发现蛋白存在磷酸化、泛素化或甲基化修饰只是第一步，真正关键的是进一步确定：修饰具体发生在哪个氨基酸位点？哪个位点是调控蛋白功能的关键？

LC-MS/MS结合高分辨质谱分析，可以通过检测修饰肽段的质量变化和碎片离子信息，精准定位蛋白翻译后修饰（PTM）位点。

辉骏生物从LC-MS/MS位点鉴定流程、磷酸化/甲基化/泛素化修饰位点鉴定及Nature Communication文献案例，系统讲解如何从“发现修饰”进一步找到“关键修饰位点”。

LC-MS/MS位点鉴定流程

简单来说，LC-MS/MS鉴定蛋白修饰位点主要分为5步：

MS负责发现“有没有修饰”；

MS/MS负责判断“修饰在哪里” ；

点突变负责验证“这个位点是否关键”。

LC-MS/MS鉴定磷酸化位点

IP-MS分析鉴定出Exo70蛋白的S89位点存在候选磷酸化修饰（图1a）。

ULK1底物保守基序分析进一步预测Exo70的S47、S59和S194为候选磷酸化位点（图1b）。

构建单点、双点及三重突变体，IP-WB检测发现S47A和S59A突变均降低磷酸化水平，而S47A/S59A/S89A三重突变完全阻断ULK1诱导的磷酸化（图1c）。

体外激酶实验进一步证实S47、S59和S89是ULK1直接磷酸化Exo70的关键位点（图1d）。

图1 LC-MS/MS鉴定磷酸化位点

LC-MS/MS鉴定甲基化位点

IP-MS分析鉴定出AML1-ETO蛋白的Lys43位点存在单甲基化修饰（图2e）。

IP-WB结果表明野生型AML1-ETO（HA-AE-W）存在明显的甲基化（图2f）。

构建K43R和K24R点突变体，发现K43R突变后甲基化信号消失，而K24R突变后无明显变化，表明K43是AML1-ETO蛋白单甲基化的关键位点（图2f）。

图2 LC-MS/MS鉴定甲基化位点

LC-MS/MS鉴定泛素化位点

IP-MS分析鉴定出Malt1A蛋白的K648位点存在Hectd3依赖性的泛素化修饰（图3a）。

泛素化IP-WB结果表明K648是Hectd3介导Malt1A泛素化的关键位点（图3b）。

图3 LC-MS/MS鉴定泛素化位点

三类常见修饰位点鉴定方法对比

除了以上修饰，LC-MS/MS还可用于乙酰化、SUMO化、糖基化、脂酰化等多种蛋白修饰。

辉骏生物自有质谱检测平台，拥有15年蛋白质谱鉴定经验，擅长IP、pull-down产物等微量蛋白的质谱鉴定及生信分析。

为什么有时鉴定不到修饰位点？

常见原因包括：

图4 修饰位点鉴定失败原因

因此，针对特定蛋白进行修饰位点鉴定时，建议质谱前先通过Input-WB、IP-WB或SDS-PAGE确认目的蛋白已经成功富集。

辉骏生物IP-MS蛋白互作组学解决方案

蛋白修饰位点能否精准鉴定，很大程度取决于前期目标蛋白富集效果和后续质谱检测质量。

辉骏生物可提供IP富集 → Input/IP-WB质控 → LC-MS/MS鉴定 → 生信分析 → 修饰位点验证的一站式蛋白修饰研究方案。

无论是磷酸化、泛素化、甲基化，还是其他蛋白翻译后修饰研究，均可根据课题需求提供对应技术支持。

需要蛋白质谱鉴定、蛋白修饰位点鉴定小伙伴可联系辉骏生物

总结

一个完整的蛋白修饰研究路线通常包括：修饰筛选 → LC-MS/MS定位 位点→ 点突变验证 → 修饰水平检测 → 功能分析。

LC-MS/MS解决：“蛋白在哪里发生修饰？”而点突变和功能实验进一步回答：“这个修饰位点是否影响蛋白功能？”只有将质谱鉴定与机制验证结合，才能真正解析蛋白翻译后修饰调控网络。