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GST pull down实验原理


GST pull down技术是体外条件下研究蛋白质相互作用的方法。先将体外表达的GST融合蛋白结合到谷胱甘肽Beads上,再将靶蛋白-GST-Beads和细胞裂解液孵育,这样互作蛋白便一起吸附在Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后,再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来,即GST pull down产物。这种互作复合物既可以用Western Blot检测已知蛋白,也可用质谱鉴定出未知蛋白。



辉骏生物10年科研服务经验,专业提供分子互作实验服务,包括蛋白与蛋白、蛋白与DNA、蛋白与RNA、RNA与RNA的相互作用技术,经验丰富,实验结果稳定可靠。

我公司自有分子、细胞和质谱实验平台,能执行最优的实验路线,微量互作蛋白质谱鉴定有充足把控力,对后续功能分析有独到见解。

我们不仅会提供专业的售前方案建议、而且售后技术支持将一直保持到文章发表,确保您安心进行下游实验及投稿

目前,客户已在Nature子刊、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功发表大量高分文章(点击查看客户文献)





GST pull-down * 实验流程


gst pulldown实验详细步骤_GST-pull down实验技术服务外包_GST标签蛋白.jpg


GST pull-down * 应用背景


蛋白-蛋白间的相互作用是蛋白质发挥生物学功能的主要模式,蛋白质会通过结合不同的伙伴来行驶不同的功能,形成复杂的信号转导网络。常见的蛋白相互作用方法主要有免疫共沉淀(Co-IP)、pull down、酵母双杂交、荧光双分子互补(BiFC)、荧光共定位等。


pull down技术将目标蛋白进行体外原核表达,使标签蛋白(GST或His等)与目标蛋白融合表达,借助标签的亲和介质将目标蛋白纯化出来,可以不受抗体、物种限制,比较轻松的获得目标蛋白的结合蛋白,还可以通过外源同时表达目标蛋白和待测蛋白,确定它们是否发生直接的相互作用,或者确定两个蛋白结合的结构域,但该方法无法得知体内真实的结合情况。


联系技术支持
18927549347、13430303037



GST pull-down * 辉骏服务内容


 服务项目服务内容结果交付实验周期  
客户提供价格

GST pull down WB

(验证型)

诱饵蛋白原核表达载体构建(选做)载体质粒、测序结果和实验报告4-5周

诱饵基因质粒模板

实验样本

待测蛋白抗体

实验信息表

点击询价



诱饵蛋白原核表达和Western blot检测诱饵蛋白Western blot检测图
样本中待测蛋白的Western blot检测待测蛋白Western blot检测图

GST pull down捕获诱饵蛋白及其互作蛋白

(实验组、空载对照组)

诱饵蛋白Western blot检测图

pull down实验报告

GST pull down  MS

(筛选型)       

诱饵蛋白原核表达载体构建(选做)

载体质粒、测序结果和实验报告

6-7周      

诱饵基因质粒模板

实验样本

实验信息表

点击询价

诱饵蛋白原核表达和Western blot检测诱饵蛋白Western blot检测图

GST pull down捕获诱饵蛋白及其互作蛋白

(实验组、GST对照组、裂解液对照组)

诱饵蛋白Western blot检测图

pull down实验报告

LC-MS/MS检测及数据分析

质谱检测结果及报告

互作蛋白筛选表格

生物信息学分析结果和报告



GST pull-down * 样本要求


样本类型

GST pull down WB建议送样量

GST pull down MS建议送样量

动物细胞3*10e7个细胞/组(约3个10cm皿)5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿)
动物组织1g/组2g/组
植物叶片2g/组4g/组
植物根或果实4g/组
8g/组
菌体50ul菌体沉淀/组100ul菌体沉淀/组

▲注意:这里列出的均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。

 保存及运输:-80℃保存,干冰取样/运输,至少在送样前2天通知我司。



GST pull-down * 结果示例


GST pull down试验服务结果分析

GST pull down WB结果图(阳性)



GST-pull down外包实验服务结果分析

GST Pull-down MS:Western blot检测图



GST pull down实验服务费用价格实惠质量高

GST pull-down MS:质谱检索表格(部分展示)



pull down生信分析结果.jpg

GST pull-down MS:互作蛋白生信分析结果(部分展示)


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GST pull-down服务案例—客户文章解析


Chen S.L. et al:  A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 2018. (中科院1区,IF=13.312).


GYS2/p53负反馈环抑制HBV相关性肝细胞癌的肿瘤生长



研究概述

糖代谢异常是癌症的突出特征,作者前期研究发现肝细胞癌(HCC)中糖原含量降低,并与患者总体生存情况不良相关,探索HCC中的异常糖代谢机制或许可以为肝细胞癌的治疗提供新靶点。本研究首次报道了HCC组织中的糖原含量显著降低,并与患者的不良预后相关,这归因于新发现的HBx/GYS2/p53信号轴。低表达的GYS2促进HCC细胞增殖而非迁移,并提供了两条独立的证据来支持GYS2和p53之间的关系。一方面,GYS2与MDM2竞争结合p53,以稳定p53免于蛋白酶体降解;另一方面,p53以负反馈方式抑制GYS2表达和糖原含量。这些数据表明p53和GYS2可能通过平衡彼此的表达而在HCC中发挥功能。


摘要图.png


研究路线

RNA-seq和qPCR等结果显示HCC组织中的GYS2(糖原合成酶2)显著下调,并与患者不良预后相关
细胞和小鼠实验表明GYS2的缺失促进了肝癌细胞增殖和肿瘤生长
GYS2敲除细胞的RNA-seq实验发现p53通路都受到明显抑制
Co-IP和 GST pull down证明GYS2通过与p53的直接相互作用发挥肿瘤抑制功能
CO-IP和GST pull down实验发现GYS2、p53和E3泛素连接酶MDM2相互作用形成复合体,GYS2与p53竞争结合MDM2来抑制p53泛素化,稳定p53蛋白水平
荧光素酶和ChIP等实验表明p53蛋白结台GYS2启动子,通过p300介导的乙酰化,在转录水平上抑制GYS2
对HBV阳性肝中的关键致癌蛋白HBx的研究发现,HBx、HDAC1与乙酰化的p53相互作用,共同抑制了GYS2




GST pull down服务 * 客户文章


1. Yu C.P. et al: Flot2 acts as a novel mediator of podocyte injury in proteinuric kidney disease. Int J Biol Sci. 2023,IF=10.75.
【研究内容】:足细胞损伤是慢性肾脏疾病(CKD)的常见标志。本研究证实Flot2在足细胞中表达,且能减少足细胞损伤。在LPS/ADR诱导肾病小鼠模型中,足细胞特异性Flot2的缺失会加重蛋白尿、足细胞损伤和肾小球病变。通过GST pull down和Co-IP实验,发现Flot2和podocin通过SPFH结构域直接相互作用。同时还发现Flot-2是转录因子KLF15的直接靶点。
使用相关技术: GST pull down实验、免疫共沉淀Co-IP


2. Jiang L. et al: Bach1 Represses Wnt/β-Catenin Signaling and Angiogenesis. Circ Res. 2015,IF=14.467.
【研究内容】:Wnt/β-catenin信号在内皮细胞的血管生成活性中起重要作用。过表达实验表明,转录因子Bach1过表达可抑制后肢缺血小鼠的血管生成,并抑制Wnt3a刺激的血管生成反应和人脐静脉内皮细胞Wnt/β-catenin靶基因的表达。Co-IP实验和gst pull-down分析表明,Bach1直接与TCF4结合,并减少β-catenin与TCF4的相互作用。研究揭示了Bach1抑制外周缺血损伤后的血管生成的作用机制,为血管生成治疗或其他涉及Wnt/β-catenin通路异常调节的疾病提供了新的治疗靶点。
使用相关技术: GST 融合蛋白、GST pulldown实验、GST pull-down技术


3. Wang J. et al: ENO1 Binds to ApoC3 and Impairs the Proliferation of T Cells via IL-8/STAT3 Pathway in OSCC. Int J Mol Sci. 2022, IF=6.208.

【研究内容】:α-烯醇化酶(ENO1)是一种代谢酶,与口腔鳞状细胞癌(OSCC)淋巴转移有关。本研究通过GST pull down MS寻找与转移性OSCC患者术后淋巴引流液(PLD)中的ENO1相互作用的蛋白,发现了ENO1的新互作蛋白ApoC3。两者的结合引起白细胞介素(IL)-8的产生,进而激活Jurkat T细胞STAT3信号通路,促进细胞凋亡,抑制Jurkat T细胞增殖。

使用相关技术: GST pull-down MS实验,gst pulldown实验,LC-MS/MS质谱鉴定


4. Yan Z.J. et al:Four Chemotherapeutic Compounds That Limit Blood-Brain-Barrier Invasion by Toxoplasma gondii. Molecules. 2022, IF=4.927.
【研究内容】:刚地弓形虫可导致弓形虫脑炎(TE)和神经系统疾病。先前的蛋白质组学发现弓形虫感染后大鼠大脑中C3的表达上调。本研究通过GST pull down MS实验,筛选了与C3a直接相互作用的BEnd3细胞膜蛋白。并通过动物行为学实验发现四种化疗药物(SB290157、CVF、NSC23766、Anxa1)均能抑制宿主TE和认知行为,其中Anxa1是抑制小鼠TE最合适的物质。
使用相关技术: GST-pull down实验gst pull down-ms实验,LC-MS/MS蛋白质谱鉴定




GST pull down * 辉骏服务优势


1
近十年服务经验,服务客户众多,案例发表在Nature Cell Biology、Nature Plants、Cancer Research等知名期刊上
2
对蛋白互作的筛选鉴定理解深刻,擅长针对客户具体情况提出合适的方案建议
3
自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线
4
自有蛋白质组学平台,对微量CoIP实验产物的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解
5
售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心免疫共沉淀下游实验及投稿


GST pull-down试剂盒-高效纯化 高灵敏 特异性强-辉骏生物价格低


辉骏实力


辉骏DNA-pull down实验技术外包服务

辉骏生物提供的GST Pull down实验技术服务分为以下两种:


1. GST Pull down WB,用于体外检测诱饵蛋白与某样本中的待测蛋白是否存在相互作用;

2. GST Pull down MS,用于体外筛选诱饵蛋白与某样本中的哪些蛋白具有相互作用。


GST pull down检测服务

服务项目服务内容结果交付实验周期  
客户提供价格
GST pull down WB构建诱饵蛋白的GST原核表达载体(可选做)载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告约2周        

1、含有诱饵基因序列的质粒模板及测序文件

2、实验样本

3、待测蛋白抗体

4、实验信息表(样本信息、诱饵蛋白和待测蛋白序列)

点击询价



原核表达诱饵蛋白并进行Western blot检测Western blot检测图4-5周
Western blot检测待测样本中的猎物蛋白Western blot检测图

GST pull down捕获诱饵蛋白及其互作蛋白

(2组:实验组、空载对照组)
pull down实验报告
Western blot检测Pull down产物中的诱饵蛋白和待测蛋白Western blot检测图
GST pull down  MS       
构建诱饵蛋白的GST原核表达载体(可选做)

载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告

约2周      

1、含有诱饵基因序列的质粒模板及测序文件

2、实验样本

3、实验信息表(样本信息、诱饵蛋白序列)

点击询价

原核表达诱饵蛋白并进行Western blot检测Western blot检测图4-5周

GST pull down捕获诱饵蛋白及其互作蛋白

(3组:实验组、空载对照组、裂解液对照组)
pull down实验报告
Western blot检测pull down产物中的诱饵蛋白Western blot检测图
LC-MS/MS定性检测pull down产物的蛋白、筛选实验组独有蛋白(潜在互作蛋白)质谱检索表格、互作蛋白筛选表格、检测报告
针对互作蛋白做生物信息学分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息学分析结果和报告1周


联系技术支持了解pull down实验服务排期、优惠等
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GST pull down技术服务优势*辉骏生物

1
近十年服务经验,众多服务案例,服务成果得到优秀期刊认可
2
对蛋白互作的筛选鉴定理解深刻,擅长针对客户情况提出合适的方案建议
3
自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线
4
自有蛋白质组学平台,对微量互作蛋白的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解
5
售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心进行下游实验及投稿





GST pull down实验服务样本要求


1. 送样量要求

样本类型

GST pull down WB建议送样量

GST pull down MS建议送样量

动物细胞3*10e7个细胞/组(约3个10cm皿)5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿)
动物组织1g/组2g/组
植物叶片2g/组4g/组
植物根或果实4g/组
8g/组
菌体50ul菌体沉淀/组100ul菌体沉淀/组


▲注意:这里列出的均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。

 


2. 样本保存和运输要求:


(1)样本用PBS清洗干净后,离心去掉液体,先放入液氮中速冻,再转移至-80℃冰箱中保存;

(2)样本一定要做好标记,应用油性防冻记号笔或标签纸在管上注明样本名称或编号;

(3)样本较多或需要分批做,要将样本分装;

(4)干冰取样/运输;需要至少在送样前一天通知我方。

 




GST pull-down实验结果示例


GST pull down试验服务结果分析

gst pull down WB:Western blot检测图(阳性)


GST-pull down外包实验服务结果分析

GST Pull-down MS:Western blot检测图


GST pull down实验服务费用价格实惠质量高

GST pulldown MS:质谱检索表格(部分展示)


pull down生信分析结果.jpg

GST pulldown MS蛋白生信分析结果示例



GST pull down实验服务客户文章


1. Chen S.L. et al: A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research.  2019,IF=13.312.
【研究内容】:前期研究表明,GYS2基因在HCC患者低表达,干扰GYS2基因表达导致肿瘤增殖转移。本研究通过融合表达GST-GYS2、His-p53、His-MDM2,并用GST-pull down方法,证实了MDM2与p53竞争性结合GYS2基因。相关的COIPChIP-qPCR等实验进一步阐明GYS2基因降低肿瘤增殖转移的机制。
使用相关技术: gst pulldown测定、GST-pull down质谱分析、GST标签蛋白


2. Jiang L. et al: Bach1 Represses Wnt/β-Catenin Signaling and Angiogenesis. Circ Res. 2015,IF=14.467.
【研究内容】:Wnt/β-catenin信号在内皮细胞的血管生成活性中起重要作用。过表达实验表明,转录因子Bach1过表达可抑制后肢缺血小鼠的血管生成,并抑制Wnt3a刺激的血管生成反应和人脐静脉内皮细胞Wnt/β-catenin靶基因的表达。Co-IP实验和gst pull-down分析表明,Bach1直接与TCF4结合,并减少β-catenin与TCF4的相互作用。研究揭示了Bach1抑制外周缺血损伤后的血管生成的作用机制,为血管生成治疗或其他涉及Wnt/β-catenin通路异常调节的疾病提供了新的治疗靶点。
使用相关技术: GST 融合蛋白、GST pull-down实验、GST pull-down技术


辉骏DNA-pull down实验技术外包服务


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GST pull-down试剂盒



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GST pull-down试剂盒产品简介


辉骏生物的GST pull-down试剂盒能够高效调取GST融合蛋白在各类样本中的互作蛋白。在GST pull-down实验前,先通过基因工程技术手段将目标基因和GST基因序列连接起来,并导入大肠杆菌中进行原核表达和纯化,之后融合蛋白通过GST标签与固相化在载体上的GTH( Glutathione)亲和结合。接下来,当样本中与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。



GST pull down试剂盒组分


 试剂名称 体积 保存条件
 GST标签纯化树脂 900 μL 4 ℃
 裂解缓冲液(PH 7.4) 24 mL 4 ℃
 漂洗缓冲液(5×) 80 mL 4 ℃
 洗脱缓冲液(PH 2.0) 1.2 mL 4 ℃




GST Pull down试剂盒产品优势*辉骏生物


1、GST融合蛋白与树脂亲和力强,可以高效纯化目标蛋白及其互作蛋白;

2、适用范围广,可用于动物组织、细胞、植物组织、微生物等各种类型的样本;

3、操作简便,周期短。

gst pulldown试剂盒-操作简便-周期短-辉骏生物.png




GST pulldown试剂盒使用流程简述


1. 通过原核表达系统表达带有GST标签的融合蛋白;

2. 在细菌上清液中加入GST标签亲和纯化树脂,4 ℃孵育2 小时;

3. 将待测样本裂解液加入上述体系中,4 ℃孵育过夜;

4. 漂洗、洗脱得到目标蛋白及其互作蛋白复合物。



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