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服务介绍应用案例

Label free技术实验原理


Label-free是一种非标记的定量蛋白质组学技术,不需使用同位素标签做内部标准,直接根据肽段质谱峰的强度对蛋白进行相对定量。

不同样本提取的蛋白质进行定量,取等量蛋白分别进行胰酶酶解,之后纯化的各组肽段分别做LC-MS/MS分析;采用特定软件检索原始质谱数据,解析出不同样本中各个肽段的定量信息,进而获得蛋白质在不同样本中的定性和定量信息



 

Label-free实验服务流程


label free蛋白_label free技术服务价格_label free蛋白组学检测.jpg




label-free技术应用


1、蛋白鉴定和定量;
2、差异蛋白的筛选和鉴定。

 




label free实验检测*辉骏服务优势

1

近十年服务经验,众多服务案例,服务成果得到优秀期刊认可

2

对蛋白筛选与定量方面有独到见解,擅长针对客户情况提出合适的方案建议


3

自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线


4

售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心进行下游实验及投稿




Label free技术服务信息



项目名称

客户提供

结果交付

实验周期

Label free

原始样本(干冰运输,广州地区可上门取样)

样本信息表

分析要求
       

1、蛋白鉴定及定量结果表
2、肽段鉴定及定量结果表

3、差异蛋白结果表
4、生物信息学分析结果
5、质谱原始数据
6、实验报告

3-4




label free非标定量-客户文献



1.Hervé V. et al:Large-Scale Proteomics of the Cassava Storage Root and Identification of a Target Gene to Reduce Postharvest Deterioration. The Plant Cell.2014,IF=9.618.
【研究内容】:木薯是热带地区最重要的块根作物,但木薯采后生理快速退化(PPD)是制约木薯商品化生产的主要原因。研究者建立了一种基于图像的PPD症状量化方法,并使用Label Free非标记定量蛋白质组学方法,在木薯根中鉴定出2600多个独特的蛋白质,其中近300个蛋白质在PPD过程中表现出显著的丰度调节。基于蛋白质组学数据、酶活性和脂质过氧化检测,最终确定谷胱甘肽过氧化物酶是降低PPD的候选药物。
使用技术:label free定量蛋白组分析、Label-free实验外包服务


2.Brian D.et al:Large-Scale Label-Free Comparative Proteomics Analysis of Polo-Like Kinase 1 Inhibition via the Small-Molecule Inhibitor BI 6727(Volasertib) in BRAF V600E Mutant Melanoma Cells. Journal of Proteome Research.2015,IF=4.074.
【研究内容】:Polo-like kinase1(Plk1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在多种人类癌症中过表达,对持续的致癌增殖至关重要。为了更好地了解Plk1信号转导机制,研究者利用Label Free非标记定量蛋白质组学方法,发现Plk1特异性抑制剂BI 6727处理人黑色素瘤A375细胞后,多个蛋白的表达发生了变化。此外,研究者还通过异质核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)确定了Plk1和p53之间的新关联,从而为Plk1在癌细胞存活中的作用提供了有价值的见解。
使用技术:label-free 质谱、Label free非标定量蛋白质组学、LabelFree定量实验检测


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中文标题:小分子抑制剂BI 6727对BRAFV600E突变黑色素瘤细胞Polo样激酶1抑制作用的大规模非标记比较蛋白质组学分析

发表期刊:Journal of proteome research

影响因子:4.074

运用技术:Label Free非标定量蛋白质组学 (由辉骏生物提供技术支持)




● 内容概述


Polo-like kinase1(Plk1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,通过调节有丝分裂的进入、进展和退出,在多种人类癌症中过表达,对持续的致癌增殖至关重要。本研究通过利用定量蛋白质组学策略来比较Plk1特异性抑制剂BI 6727处理后BRAFV600E突变黑色素瘤细胞的蛋白质组,利用无标记纳米LC−MS/MS技术在Q-Exactive上进行筛选,鉴定了20多个感兴趣的蛋白;并通过乳酸和NAD水平来评估与细胞代谢相关的降低。此外,研究中还发现了多个蛋白酶体亚基的下调,导致20S蛋白酶体活性显著降低。有关异质核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)的检测也进一步确定了Plk1和p53之间的新关联,从而为Plk1在癌细胞存活中的作用提供了有价值的见解。

 




● 研究路线


1
Label free非标记定量蛋白质组学分析BI 6727抑制PIk1后人黑色素瘤细胞蛋白质组的定量变化
2
Panther分析评估集体蛋白质的分子功能,确定催化活性和结合是主要的蛋白质功能
3
NAD、NADH和 NADPH检测结果表明P1k1抑后NADH和NADPH水平显著降低,NAD的下降幅度更大
4
20S蛋白酶体活性测定结果表明BI 6727治疗导致多个20S蛋白酶体亚基下调
5
异质性核糖核蛋白C1/C2检测结果表明P1k1通过调节 HNRNPC介导的p53表达





● 研究结果


1. BI 6727处理、蛋白质鉴定、定量和分析

 

为确定Plk1在黑色素瘤中的下游分子机制,研究者阐明了BI 6727抑制Plk1后人黑色素瘤细胞蛋白质组的定量变化。使用Label Free方法进行分析,为准确确定蛋白质比例,每种样本类型设置了三个以上的实验重复。该方法识别出1800多种蛋白质,其中343种被识别的蛋白质表现出显著的表达变化。


接下来,研究者使用Panther(通过进化关系进行蛋白质分析)来评估集体蛋白质的分子功能,并确定催化活性和结合是主要的蛋白质功能(图2C)。

 

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2. BI 6727治疗改变多种代谢蛋白的表达


蛋白质组学分析结果表明,Plk1活性的抑制导致多种代谢蛋白的表达减少,包括苹果酸脱氢酶1(MDH1)、谷草转氨酶2(GOT2)和转酮醇酶(TKT)。此外,Western blot结果证实了乳酸脱氢酶A(LDHA)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)和乳酸脱氢酶B(LDHB)显著降低(图3A)。有趣的是,LDHA、LDHB和GPI均在糖酵解中扮演着重要的角色。推测Plk1的过表达可能有助于癌症相关的从线粒体氧化磷酸化OXPHOS向有氧糖酵解的转换。

 

为了评估Plk1抑制对有氧糖酵解的影响,研究者分别测量了细胞外乳酸的水平,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的水平,乳酸是葡萄糖分解的主要副产品,而NADH和NADPH是糖酵解和磷酸戊糖途径分解葡萄糖过程中产生的酶辅助因子。结果显示两个治疗组(25 NM和100 NM)的乳酸水平与对照组相比显著降低(图3C)。在BI-6727处理的细胞中,NADH和NADPH水平显著降低,几乎降低了5倍(图3D)。这些数据表明,Plk1抑制后NAD+的下降幅度更大,鉴于丙酮酸到乳酸的转化是NAD+再生的主要途径,有理由预测LDHA的下降是比率变化的主要因素。

 

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3. BI 6727治疗导致多个20S蛋白酶体亚基下调


 泛素-蛋白酶体系统通过一个系统过程对细胞内80%~90%的蛋白质降解起着不可或缺的作用。在比较蛋白质组学分析中,研究者发现BI6727治疗导致人黑色素瘤细胞中多个20S亚基的显著下调。进一步扩大IPA分析范围,发现20S亚基α7和β6分别下调了2.46%和5.56%(图4B)。使用荧光团标记的蛋白酶体底物检测了20S蛋白酶体的活性,检测显示,与对照组相比,BI 6727处理细胞的20S活性显著降低(图4D)。

 

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4. 异质性核糖核蛋白C1/C2在BI 6727治疗后上调

 

异质性核糖核蛋白C1/C2(HNRNPC)是一种普遍存在的RNA结合蛋白,主要以hnRNPC1和hnRNPC2两种异构体表达。最近的一项研究表明,HNRNPC过表达通过抑制有丝分裂蛋白极光激酶B(AurkB)在肝细胞癌(HCC)细胞中诱导微核。Plk1活性的抑制可能会对AurkB的表达产生负面影响,与Plk1抑制相关的有丝分裂可能部分通过HNRNPC和AurkB介导。此外,HNRNPC被证明通过直接与p53 mRNA 5‘编码区的顺式元件结合来促进p53的翻译。研究者分别通过Western blot和p21的转录分析发现p53蛋白的表达和活性相应地增加(图5E)。这些数据为Plk1通过调节HNRNPC介导的p53表达提供了令人信服的证据。

 

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● 结论


对BI 6727抑制人黑色素瘤A375细胞Plk1的蛋白质组学研究发现,多个蛋白的表达发生了变化,这些蛋白尚未被确定为Plk1信号网络的一部分。蛋白质组学分析提供了Plk1和HNRNPC之间一种新的关系的证据,并且Plk1抑制对厌氧糖酵解和蛋白酶体活性有相当大的影响,这两条途径是癌细胞生存所必需的。这些数据为新的Plk1信号通路和未来靶向治疗的潜在候选者提供了坚实的基础。

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