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实验简介买此服务

ChIP(chromatin immunoprecipitation assay, 染色质免疫共沉淀)是研究体内DNA与蛋白结合的重要技术,主要包括ChIP-qPCR和ChIP-seq两种;其中ChIP-qPCR用来验证与目标蛋白结合的已知DNA片段,ChIP-seq用来筛选与目标蛋白结合的未知DNA片段。




染色质免疫沉淀ChIP实验原理


先用甲醛交联细胞内“蛋白-DNA”复合物,并用超声波破碎DNA至适合的长度。细胞裂解后,孵育结合了抗体的珠子,诱饵蛋白通过其抗体便结合到了Beads上,同时和诱饵蛋白互作的DNA,也一起沉淀到Beads上。洗涤掉未结合的DNA后,再用洗脱液将DNA-蛋白复合物从Beads洗脱下来,便得到染色质免疫共沉淀产物。DNA-蛋白复合物去交联后,既可qPCR检测已知DNA片段,也可用二代测序与蛋白互作的DNA片段。


当没有合适的诱饵蛋白抗体时,可以通过表达融合了flag标签的诱饵蛋白,利用flag标签做免疫沉淀。即细胞过表达Flag-Bait,经裂解后与anti-Flag珠子孵育,诱饵融合蛋白与Beads结合,与诱饵融合蛋白互作的DNA“共沉淀”到Beads上,再经洗涤、洗脱后做qPCR或NGS测序。





染色质免疫沉淀ChIP实验流程

ChIP-qPCR实验,染色质免疫共沉淀ChIP技术服务,DNA与蛋白互作外包平台.jpg
带标签的染色质免疫共沉淀流程图:
染色质免疫共沉淀ChIP实验_代做染色质免疫共沉淀实验_ChIP技术检测.jpg




应用领域


coip技术服务.bmp






ChIP技术应用背景




◆ 基因表达是一个复杂、调控有序的过程,DNA与蛋白质的相互作用是基因转录起始和调控的关键,研究它们的相互作用是研究染色质上基因表达调控的重要领域。


chip(染色质免疫共沉淀)是检测体内条件下DNA与蛋白质相互作用的方法,该技术由 Orlando等于1997年创立,目前已广泛应用于组蛋白修饰、转录因子作用位点和DNA甲基化等研究中。


转录因子也称为反式作用因子,是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用来激活或抑制基因表达的DNA结合蛋白。转录因子有4个主要结构域:DNA结合域决定了转录因子的特异性,转录调控域(包括激活域或抑制域)决定了转录因子的功能,寡聚化位点使不同转录因子间发生相互作用,核定位信号控制转录因子进入细胞核。


组蛋白是染色质基本结构——核小体中的重要组成部分,其N-端尾部暴露在核小体的表面,可发生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚 ADP 糖基化等共价修饰,影响组蛋白与DNA的亲和性,改变染色质的疏松或凝集状态,或影响其它转录因子与靶基因启动子的亲和性,激活或抑制基因表达。


DNA甲基化是在不改变DNA序列的前提下,由DNA甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基转移到DNA上,其中发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化(5-mC)是DNA甲基化的主要形式。甲基的引入使DNA分子空间结构改变,DNA大沟无法与DNA结合蛋白(转录因子、拓扑异构酶、RNA聚合酶、阻抑蛋白等)正常结合,导致某些基因转录失活。因此,DNA甲基化通常抑制基因表达,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。





 




ChIP实验研究案例—客户文章解析


chip技术研究案例

NCoR/SMRT与c-MYC共同抑制体细胞重编程




研究背景

研究者首先发现Ncor1(编码NCoR)和Ncor2(编码SMRT)在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、胚胎干细胞(ESC)和OSKM重编程细胞中均有表达。无论用怎样的转导方法、报告系统、MEF类型或培养基,抑制Ncor1/2的表达都能增强OSKM诱导的重编程。



研究路线

RNA-seq发现敲除NCoR/SMRT可在重编程后期激活多能性基因
基因过表达/干扰结果显示NCoR/SMART抑制重编程需要借助HDAC3去乙酰化酶活性
H3K27ac的ChIP实验表明HDAC3通过诱导多能基因位点的组蛋白去乙酰化来抑制重编程
NCoR/SMRT的ChIP实验表明NCoR/SMRT通过HDAC3介导的组蛋白去乙酰化抑制多能基因激活
COIP和ChIP等表明c-MYC与 NCoR/SMRT和HDAC3相互组用,招募它们到多能基因位点
报告基因和诱导重编程等实验发现c-myc募集NCoR/SMRT-HDAC3抑制多能基因对重编程晚期是不利的



研究结论

本研究发现NCoR/SMRT–HDAC3共抑制复合物通过与OSKM因子(尤其是c-MYC)相互作用为重编程制造障碍,这一发现揭示了c-MYC在重编程中的双重作用,也有助于解释为何用OSKM而非OSK诱导重编程更容易产生pre-iPSCs,以及为何用HDAC抑制剂对OSKM而非OSK诱导的重编程能产生更强的效果等问题。



客户文献

Zhuang Q. et al: NCoR/SMRT co-repressors cooperate with c-MYC to create an epigenetic barrier to somatic cell reprogramming. Nature Cell Biology. 2018. (IF=28.824)





辉骏实力

辉骏实验外包服务.jpg




辉骏生物提供的ChIP染色质免疫共沉淀服务分为以下两种:


1. ChIP qPCR,用于检测某样本中的诱饵蛋白和待测DNA片段是否结合;

2. ChIP seq,用于筛选某样本中的诱饵蛋白可以结合哪些DNA区域。


ChIP(染色质免疫共沉淀)检测服务
服务项目
服务内容结果交付实验周期客户提供
ChIP qPCR
Western blot检测样本(input)中的诱饵蛋白Western blot检测图5-6周

实验样本

诱饵蛋白的IP级抗体

实验信息表(样本信息,诱饵蛋白及待测DNA序列)

ChIP调取诱饵蛋白及其结合的DNA片段

(2组:实验组和对照组)
ChIP实验报告
Western blot检测ChIP产物中的诱饵蛋白Western blot检测图
qPCR检测ChIP产物中的待测DNA片段
qPCR检测数据
ChIP seqWestern blot检测样本(input)中的诱饵蛋白Western blot检测图5-6周

实验样本

诱饵蛋白的IP级抗体

实验信息表(样本信息,诱饵蛋白序列)

ChIP调取诱饵蛋白及其结合的DNA片段

(2组:实验组和对照组)
ChIP实验报告
Western blot检测ChIP产物中的诱饵蛋白Western blot检测图
seq检测ChIP产物中的DNA片段并分析
seq检测结果、检测和分析报告9周




ChIP服务优势*辉骏生物

1

近十年服务经验,服务案例众多,客户发文Nature Cell Biology等高质量期刊

2

可对围绕DNA结合蛋白开展的整体课题提供全方位方案建议

3

自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线

4

售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心进行下游实验及投稿



染色质免疫共沉淀chip样本要求


1. 送样量要求


样本类型ChIP-qPCR建议送样量ChIP-seq建议送样量
动物细胞3*10e7个细胞/组(约3个10cm皿)5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿)


▲注意:这里列出的均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。

 


2. 样本保存和运输要求:

(1)客户收集细胞前需要先进行甲醛交联,之后收集细胞沉淀,用PBS清洗干净后,离心去掉液体,先放入液氮中速冻,再转移至-80℃冰箱中保存;广州市内的客户也可以提供活细胞(常温运输,如果冬天温度较低可以用37℃复温的冰袋保存),我方交联;

(2)样本一定要做好标记,应用油性防冻记号笔或标签纸在管上注明样本名称或编号;

(3)样本较多或需要分批做,要将样本分装;

(4)干冰取样/运输;需要至少在送样前一天通知我方。

 




Chip实验结果示例


图片.png

ChIP qPCR检测数据



  ChIP组相对于input组的富集图(% input)


ChIP组相对于IgG组的富集图

            



                                                                                   


chip实验客户文章


1.Zhuang Q. et al: NCoR/SMRT co-repressors cooperate with c-MYC to create an epigenetic barrier to somatic cell reprogramming. Nature Cell Biology.2018,IF=17.728.
【研究内容】:客户通过RNA-seq证明了NCoR/SMRT共抑制子与多能位点结合,IP实验、ChIP-qPCR分析进一步表明,NCoR/SMRT-HDAC3复合物在OSKM重编程中诱导组蛋白去乙酰化的多能位点。ChIP-seq分析发现,NCoR/SMRT中还存在着一个c-MYC结合基序。研究揭示了NCoR/SMRT共抑制子在重编程中的作用,并提出了c-MYC在这一过程中的双重功能。
使用相关技术:染色质免疫共沉淀ChIP、chip qpcr实验


2.Wang R.H. et al: A requirement for breast-cancer-associated gene 1(BRCA1) in the spindle checkpoint. PANS. 2004,IF=9.58.
【研究内容】:研究表明BRCA1缺陷型细胞的有丝分裂受到影响,存在纺锤体检查点缺陷。客户检测和纺锤体检查点密切相关的几个基因,发现BRCA1缺陷型Mad2基因表达水平变化明显,由此推测BRCA1是通过影响Mad2的表达,从而影响有丝分裂的。DNA pulldown及ChIP-qPCR实验证实了BRCA1可以和Mad2启动子结合,进一步研究发现BRCA1确实上调Mad2从而影响有丝分裂。
使用相关技术:chip技术服务、染色质免疫共沉淀ChIP-seq

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