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TAP-MS串联亲和纯化质谱实验原理


过表达TST-Flag双标签融合蛋白的细胞,经裂解后先与Streptactin珠子孵育、初次洗涤及洗脱,释放出蛋白复合物;再将此蛋白复合物与anti-Flag珠子结合、再次洗涤,最后的洗脱产物用质谱鉴定未知的互作蛋白。





TAP-MS串联亲和纯化质谱实验流程


代做串联亲和纯化-质谱,tap ms实验.jpg




应用领域



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TAP MS应用背景


随着确定细胞内蛋白质的相互作用成为当今生命科学的研究热点,双杂交技术已经广泛应用于研究蛋白—蛋白间的相互作用,但由于其筛选步骤复杂,假阳性结果较多,难于量化,故不能满足大规模蛋白质研究的需要,因此串联亲和纯化(TAP)技术以其高效、高纯度、以及能够高度模拟真实生理条件等优势,迅速成为筛选、发现和鉴别新的相互作用蛋白质的主流技术之一。

目前,TAP技术与质谱技术的联用,以及质谱技术的自动化,使得大规模地分析相互作用的蛋白质在技术上成为可能。

TAP技术采用两步亲和纯化,提高了纯化产物的特异性,具有周期短、假阳性结果少等优点。通过这种方法鉴定到的蛋白质相互作用能真实地反映出细胞中蛋白质分子之间的联系,实验结果更加接近真实情况,而且TAP技术还特别适用于蛋白质组水平上的大规模研究。





TAP-MS实验研究案例—客户文章解析



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鸟嘌呤核苷酸交换因子的差异rac1信号涉及FLII在调节rac1驱动的细胞迁移中的作用



研究背景

 

小的GTP酶 rac1与肿瘤的形成和扩散有关。当被鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)激活时,rac1与细胞中的各种蛋白质结合,从而调节各种功能,包括细胞迁移。然而,当在临床环境中以rac1为靶点时,rac1的激活可以导致相反的迁移表型,增加了加剧肿瘤进展的可能性。这就需要确定影响rac1驱动的细胞运动的因素。



研究路线

1

过表达与 pull down实验证实Tiam1和P-Rex1诱导不同的rac1下游效应

2

通过TAP/ SILAC结合的方法检测 Tiam1或 P-Rex1诱导后的rac1相互作用体,证实Tiam1和P-Rex1对racl互动体有不同的调控作用

3

免疫共沉淀、 GST pull down和PLA实验结果证实FLII优先与活性racl结合FLII是一种新的富含P-RExl的rac1结合伙伴

4

结构域分析证实FLII通过不同的结构域与rac1和P-Rex1结合

5

Pull down实验和细胞迁移实验证实FLII是P-REx1-rac1驱动的细胞迁移所必需的

6

基因敲除实验表明P-Rex1可以通过FLII介导特定的细胞功能,包括细胞收缩,从而促进细胞迁移



研究结论


研究证实P-Rex1不仅能激活rac1,而且还能将蛋白质(如FLII)定向到rac1的活性形式,以介导特定的细胞功能,包括细胞收缩,从而使P-Rex1能够促进细胞迁移。因此,这项研究提供了对以前未报道的P-REx1-rac1介导细胞迁移的细胞功能的洞察力,并强调了P-Rex1和rac1可能驱动癌症扩散的其他模式。



客户文献


Hadir Marei. et al: Differential Rac1 signalling by guanine nucleotideexchange factors implicates FLII in regulating Rac1-driven cell migration.Nat Communications. 2016,IF=14.919.





辉骏实力

辉骏实验外包服务.jpg

辉骏生物提供的TAP(串联亲和纯化)服务采用flag标签和TST标签进行串联纯化,用于筛选某样本中的诱饵蛋白与哪些蛋白具有相互作用。


TAP(串联亲和纯化)检测服务
服务项目服务内容结果交付实验周期客户提供
TAP MS构建诱饵蛋白的TAP双标签表达载体
载体质粒、甘油菌、测序结果和实验报告约2周

1、含有诱饵基因序列的质粒模板及测序文件

2、待测细胞及其培养方法

3、实验信息表(样本信息、诱饵蛋白序列)
包装慢病毒并进行诱饵蛋白的稳定表达细胞株筛选慢病毒包装和稳转株实验报告5-6周
Western blot检测样本(input)中的诱饵蛋白Western blot检测图7-8周

TAP调取诱饵蛋白及其互作蛋白

(2组:实验组、空载对照组)
TAP实验报告
Western blot检测TAP产物中的诱饵蛋白Western blot检测图
LC-MS/MS定性检测TAP产物的蛋白、筛选实验组独有蛋白(潜在互作蛋白)质谱检索表格、互作蛋白筛选表格、检测报告
针对互作蛋白做生物信息学分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息学分析结果和报告1周




TAP串联亲和纯化服务优势*辉骏生物

1 近十年服务经验,服务客户众多


2 对蛋白互作的筛选鉴定理解深刻,擅长针对客户具体情况提出合适的方案建议


3自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线


4 自有蛋白质组学平台,对微量TAP实验产物的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解


5 售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心免疫共沉淀下游实验及投稿




TAP-MS实验样本要求


1. 送样量要求


样本类型
TAP-MS建议送样量
野生型细胞株

(广州市内客户)可接受活细胞,2个T25瓶,细胞汇合度>80%;

(其他地区客户)冻存细胞2管。

稳转细胞株1*10e8个细胞/组(约10个10cm皿),2组共计2*10e8个细胞


▲注意:如果客户提供初始细胞株,需要同时提供详细的细胞培养方法,广州市内客户可提供复苏后的细胞,其他地区客户请提供冻存细胞。

 


2. 样本保存和运输要求:

(1)如果客户自行准备稳转株,细胞沉淀用PBS清洗干净后,离心去掉液体,先放入液氮中速冻,再转移至-80℃冰箱中保存;

(2)样本一定要做好标记,应用油性防冻记号笔或标签纸在管上注明样本名称或编号;

(3)样本较多或需要分批做,要将样本分装;

(4)干冰取样/运输;需要至少在送样前一天通知我方。

 




串联亲和纯化TAP技术实验结果示例


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TAP MS:Western blot检测图


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TAP MS:质谱检索表格(部分展示)





TAP MS客户文章


1. Reinaldo F.M. et al: Destabilizing NEK2 overcomes resistance to proteasome inhibition in multiple myeloma. The Journal of Clinical Investigation.2020 , IF=11.864.

【研究内容】:每个骨髓瘤患者都有多个亚克隆,具有高或低染色体不稳定性(CIN)特征的多个亚克隆共存会导致异质性和耐药性,导致疾病复发。作者通过串联亲和纯化质谱(TAP-MS)技术,发现了CIN基因NEK2与脱泛素酶USP7结合。该结合阻止了NEK2泛素化并使其稳定。研究发现,使用NEK2或USP7抑制剂进行靶向治疗可能是骨髓瘤最有效的辅助治疗方法。

使用技术串联亲和纯化质谱、TAP-MS实验外包


2.  Li X.et al: Proteomic analyses reveal distinct chromatin-associated and soluble transcription factor complexes.Molecular Systems Biology.2015 ,  IF=8.991.

【研究内容】:转录因子(TF)是细胞信号通路的终极靶标和执行者。在这项研究中,作者对56个TF的可溶性和染色相关复合物进行了蛋白质组学分析,利用串联亲和纯化和质谱(TAP/MS)技术进行纯化,并鉴定其中的蛋白质-蛋白质相互作用。研究为大量的TF提供了有价值的蛋白质-蛋白质相互作用网络资源,强调了TF形成不同位置特异性的蛋白质复合物的一般原理,这些复合物与TF的不同调控和不同功能有关。

使用技术TAP MS技术服务、串联亲和纯化-质谱、串联亲和纯化实验怎么做


Flag-TST双标签免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒


 货号 规格 货期
 FI88809 10次 现货
 FI8881020次 现货



Flag-TST双标签免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒产品简介


辉骏生物的Flag-TST双标签免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒能够高效完成单标签或双标签融合蛋白的纯化及其互作蛋白的调取。以双标签融合蛋白做TAP为例,将Flag标签、TST标签与目标蛋白在目的细胞中融合表达,分别采用TST树脂和Flag树脂进行两步串联的亲和纯化,最终获得目标蛋白及其互作蛋白复合物。


FLAG-tag 是一段由8个氨基酸残基组成,N-DYKDDDDK-C (1012 Da),其作用是标记蛋白。在蛋白表达和定位研究中,可以通过基因工程技术手段将所要研究的目的基因和FLAG-tag基因序列连接起来,可以连接在目的蛋白的C端或N端,然后将整合后的基因转入细胞中或胚胎干细胞亦或受精卵中。 TST标签是strep-tagⅡ(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)的升级版,由两个strep-tagⅡ外加连接臂组成,与融合蛋白结合能力更强,结合位点更多,其作用是标记蛋白。在蛋白表达和定位研究中,可以通过基因工程技术手段将所要研究的目的基因和TST-tag基因序列连接起来,可以连接在目的蛋白的C端或N端,然后将整合后的基因转入细胞中或胚胎干细胞亦或受精卵中。



Flag-TST试剂盒试剂盒组分(20份):


 试剂名称 体积 保存条件
 TST树脂 2mL 4 ℃
 Flag树脂 1mL
 -20 ℃
 裂解缓冲液3*50mL 4 ℃
 漂洗缓冲液A 10mL
 -20 ℃
 洗脱缓冲液B 1mL
 -20 ℃



Flag-TST试剂盒产品优势*辉骏生物


1. 既可用于TST和Flag双标签蛋白的串联纯化,又可用于TST或Flag单标签蛋白的纯化;

2. 抗体与树脂偶联,因此纯化复合物中几乎不含抗体污染,Western Blot或LC-MS检测不受影响;

3. 串联纯化可以有效降低互作蛋白的假阳性率,使后续验证更加简单;

4. 亲和材料经过特殊优化,与诱饵蛋白结合更多且结合力更强。



Flag TST试剂盒使用流程简述


1. 将细胞裂解液与TST树脂,室温下孵育1-2小时,或4 ℃过夜。

2. 在室温下,经过漂洗,洗脱得到洗脱液1。

3. 在洗脱液1中加入到Flag树脂中,室温孵育2-3小时,或4 ℃过夜。

4. 室温下,漂洗,加洗脱缓冲液B得到最终洗脱产物。


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