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服务介绍应用案例常见问答

质谱是将待测物质变为气态离子并将离子按质荷比(m/z)进行分离和分析的一种方法。液质联用技术(LC-MS/MS)结合数据库检索可以进行蛋白定性,蛋白样本可以是溶液、胶条或胶点等。


辉骏生物旨在为客户提供良好的质谱鉴定服务,我们可以提供从实验设计、样品制备、质量控制、质谱处理、生物信息学和统计分析等实验内容。客户可以进行几乎所有感兴趣的研究,如蛋白质组分析、小分子的高分辨率分析、复杂环境中小分子的定量分析等。



 

LC-MS/MS蛋白鉴定技术原理


蛋白先经胰蛋白酶消化成肽段,肽段在质谱仪中离子化后,会带上一定量的电荷,通过检测器分析,可得到各肽段的质荷比(m/z),即一级质谱图;为获得肽段更详细的序列信息,部分肽段再次被破碎和分析,产生二级质谱图。最后采用质谱检索软件选择相应的蛋白数据库,对获得的全部质谱数据进行分析,同时以打分的形式将鉴定到的蛋白依次排列。





LC-MS/MS蛋白鉴定技术流程



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lc-ms/ms技术服务*辉骏生物优势


1
适用于相对复杂的蛋白质样本鉴定,可以一次性鉴定成百上千种蛋白质
2
鉴定准确性和灵敏度高




 

LC-MS/MS蛋白鉴定应用范围


★IP,Co-IP,Pull-down类蛋白相互作用样本(胶条或溶液)的鉴定;

★细胞器,外泌体等简单样本中的所有表达蛋白质的鉴定(全谱分析)。




LC-MS/MS蛋白鉴定服务信息


项目名称

客户提供

结果交付

实验周期

价格

LC-MS/MS蛋白鉴定

蛋白溶液(干冰运输)

蛋白胶条/胶点(冰袋运输)

广州地区可上门取样

样本信息表

蛋白及肽段鉴定结果表

质谱检索网页

指定肽段的质谱图

质谱原始数据

实验报告

2周

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LC-MS/MS蛋白鉴定—客户文献


1. UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. (2020 , IF=10.717).

2. Gao C.J. et al: The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signaling. Nature Plants, 5(5):512-524 (2019,IF=19.40).

3. Tang W.W. et al: The p300/YY1/miR-500a-5p/HDAC2 signalling axis regulates cell proliferation in human colorectal cancer. Nature Communications (2019,IF = 12.121).

4. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods, 15(3): 213–220 (2018,IF=28.467).




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中文标题:捕获新转录RNA的相互作用体,或促进对不同细胞和系统中总RNA结合蛋白质组的深入研究

发表期刊:Nature Methods

影响因子:28.467

合作单位:中国科学院广州生物医学与健康研究所

运用技术:LC-MS/MS蛋白质谱鉴定(由辉骏生物提供技术支持)



● 研究背景


目前系统研究RNA结合蛋白质组的方法主要是基于捕获多聚腺苷酸(PolyA)RNA,主要是带有寡聚(DT)包被珠的mRNA。然而PolyA尾巴只在新转录的RNA成熟的过程中被添加到RNA中,而一些成熟的mRNA要么是非PolyA的,要么是双态的。此外,成熟的非PolyA RNA物种占所有转录序列的很大一部分。捕获与所有类型RNA相互作用的RNA结合蛋白的方法不仅可以扩大我们目前对RNA相互作用组的看法,而且有助于理解非Polya RNA在生理和疾病中的功能。




● 研究结果


1. 利用RICK技术捕获新转录的RNA互作组


研究者用Eu标记HeLa细胞中的RNA,固定细胞后通过点击反应使Eu生物素化,然后用链霉亲和素包裹的珠子提取RNA-蛋白质复合物。凝胶电泳和银染证实Rick方法成功分离出与EU标记RNA直接相互作用的蛋白质。Western blotting验证了Rick对已知RNA相关蛋白的捕获。

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  图1



2. Rick捕获的RNA种类


研究者对Rick pull down样本进行了RNA测序(RNA-seq),分析结果(图2A)与Castello的oligo(DT)捕获数据相比显示出明显的差异,在该数据中,捕获的RNA中80%是mRNA。接下来,研究者研究了Rick样本中的富集与三种相关的非PolyA RNA:CircRNA、近端启动子RNA(ppRNA)和增强子RNA(ERNA)的oligo(Dt)捕获情况。在对ppRNA的评估中,与oligo(Dt)捕获相比,Rick样本中转录暂停基因(TR>4)在TSS周围积累了更高的RNA-seq信号,这表明仅通过Rick就能有效地分离ppRNA;而非暂停基因(TR<4)差异则很小(图2B,C)。此外,在Rick样本中,RNA-seq信号在假定的增强子区域16(6.05%)上有很强的富集,而在寡核苷酸(DT)捕获中几乎没有(0.11%)(图2D)。RT-qPCR进一步证实,与oligo(Dt)捕获相比,用Rick提取的非Polya RNA分离效果良好。简言之,除Polya RNA外,Rick还成功地分离出了其他各种RNA种类,表明它也可以富集不是通过寡核苷酸(DT)捕获方法分离的相关结合蛋白。

LC-MS/MS蛋白质谱鉴定-客户文献-辉骏生物.png

图2



3. RICK法分离蛋白质的特性研究


采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对Rick分离的蛋白质进行分析。与oligo(DT)捕获在不同条件下的比较表明,Rick分离了许多在oligo(DT)捕获研究中没有鉴定到的蛋白质)(图3B),这些差异既不是由于细胞培养、蛋白质组学程序的差异,也不是由Eu标记引起的(图3A)。


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图3

 


4. RICK分离蛋白的功能分析


对295个RICK特有的RBP进行了GO分析,观察了与有丝分裂相关的生物过程的富集(图4A)。KEGG途径分析还将“细胞周期”列为前十个最显著富集的途径(图4B)。相反,对Rick鉴定的425种蛋白质进行的GO和KEGG分析显示,oligo(dT)捕获数据集中存在的蛋白质主要与RNA相关。综上所述,这些数据进一步加强了Rick在分离用寡核苷酸(DT)捕获方法未鉴定出的蛋白质方面的独特性,并揭示了RNA在意想不到的细胞过程中的功能。

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图4


 

5. RICK识别与非polyA RNA优先结合的蛋白质


考虑到通过Rick和oligo(DT)捕获分离的RNA种类的显著差异,295个RICK特有的RBP中有相当一部分可能优先与非polyA RNA结合。这种特异性可能是由于化学计量学、亚细胞定位或潜在的内在结合特异性。LC-MS/MS鉴定出914个高置信度蛋白质,称之为“PolyA缺失型Rick蛋白”。在这914个蛋白质中,576个与标准Rick程序的720个高置信度蛋白质重叠(图5A)。进一步分析表明,295个RICK特有的RBP中有204个(69.2%)与914个PolyA缺失型Rick蛋白重叠(图5B)。此外,在710个与RICK特有RBP不重叠的710个polyA缺失型RICK蛋白中,有563个出现在oligo(DT)捕获数据集中(图5B),这表明这些蛋白具有结合PolyA和非PolyA RNA的混合趋势。这些结果表明,Rick可用于鉴定优先与非Polya RNA结合的蛋白质。


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图5

 


6. 与METTL1和CDK1相互作用的RNA特性 


我们选择了两个Rick特有的RBP METTL1和CDK1,用PAR-CLIP测序方法研究了它们相互作用的RNA。METTL1的两个独立PAR-CLIP测序实验显示捕获的RNA存在广泛重叠,其中很大一部分也被RICK捕获。进一步分析证实METTL1与tRNA显著结合,还与多种推测为非polyA的RNA结合,如内含子RNA和从基因间区域转录的RNA(图5C)。接下来,研究者使用随机六聚体或寡聚体(dT)引物进行RNA免疫沉淀(RIP),然后进行RT-qPCR,以识别METTL1靶RNA是否具有polyA尾巴。RIP-qPCR显示,使用随机六聚体富集了7个mRNA,而使用寡聚(DT)引物只能扩增出其中的3个,证实了METTL1与含有mRNA序列的非PolyA RNA结合(图5D)。CDK1 PAR-CLIP测序分析显示与转录自基因间区域和内含子RNA的RNA结合,与RICK捕获的RNA也存在广泛重叠。后续分析进一步表明,METTL1和CDK1广泛地与非PolyA RNA结合,暗示这两种蛋白的RNA相关功能被忽视。

 



7. 利用RICK捕获新生RNA互作组


研究者对HeLa细胞进行了短Eu标记(0.5、1和2小时),以研究Rick是否可以捕获与新生RNA互作的蛋白。鉴定了208种不同的高置信度蛋白质(分别为149、119和143,作用时间分别为0.5、1和2小时),称之为“新生富集RBP”和319种低置信度蛋白质(图6A)。对208个新生富集RBP进行的GO和KEGG通路分析显示,转录和RNA代谢相关术语显著丰富(图6B)。进一步的研究表明,新生RNA转录和局部代谢物产生之间存在联系,从而调节表观基因和潜在的表观转录基因。

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图6

 


8. 利用RICK获取mESC总RNA互作组


为证明Rick可以应用于其他类型的细胞,研究者用链霉亲和素结合辣根过氧化物酶证实了Eu在mESC中的有效掺入,并进行了LC-MS/MS,鉴定出518个高置信蛋白和304个低置信蛋白。这518个高置信度蛋白质中有160个与Kwon等人报告的“mESC mRNA相互作用组”重叠,而358个是RICK独有的,因此将其称为RICK独有的mESC RBP。对这358个候选限制性商业惯例的GO分析显示,RNA结合或PolyA RNA结合术语丰富。在这358个蛋白中,有95个在mESC中的表达水平高于分化后的细胞,这表明mESC在自我更新或多能性方面具有潜在的作用。因此,Rick可以应用于HeLa以外的不同细胞类型;此外还需要进一步的研究来确定新发现的候选RBP在mESC自我更新/多能性中的作用。



辉骏生物实验外包服务商,10年专注科研实验,专业提供全方位蛋白质组学蛋白/核酸互作代谢组学分子/细胞生物学lncRNA专题实验等科研服务。辉骏自有蛋白质组学平台,对蛋白的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解。


目前,我们已为上千位客户在Nature、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功发表IF>10的高分文献(点击查看客户文献),欢迎各位咨询lc-ms/ms检测实验,实验电话:4006991663

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Q1:蛋白质谱鉴定不成功一般有哪些因素?

A:质谱鉴定不成功主要可以分为两类,一类是质谱效果不好,一类是没有可参考的蛋白数据库,质谱效果不好的原因又可以细分为蛋白点太淡以至于蛋白含量过低(常见银染的点)、蛋白酶解及质谱操作失误等,要避免这些因素要尽量取颜色深一些的蛋白点,并且取的蛋白点面积需要适当大一些。


Q2:做蛋白鉴定检索时为什么同一个编号对应了很多蛋白质?

A:因为一个蛋白家族中常常含有多个同源性很高的蛋白质,这些蛋白质被酶切之后,很可能会产生很多相同的肽段,软件在进行定性分析时,就会将这些肽段均归于得分高的那种蛋白质,其他同源蛋白不计分,并且这些同源蛋白都采用同一编号。


Q3:怎么判定哪些蛋白是和自己研究相关的蛋白,挑选什么样的蛋白进行后期实验验证

A:需要研究人员根据自己研究的相关生物学背景,再结合生物信息学分析的结果,以及查看相关的文献资料来确认哪些蛋白可以用于后续深入的研究。后期的蛋白验证实验,一般情况下是根据客户的需要,结合课题本身,在所筛选到的差异的蛋白中,找到自己关注的蛋白。并且在挑选的时候尽量挑蛋白可信度高的、差异变化较明显的蛋白。目前验证实验的成功率比较低,一般情况下能有50%的概率已经是非常好的结果。


Q4:蛋白质鉴定结果较少的可能原因是什么?

A:●根据样品SDS-PAGE图(注:SDS-PAGE无过度染色情况),判断样本本身的蛋白质丰富程度,蛋白质条带较少或者较浅(含量低)都会导致鉴定结果不佳,可考虑增加样本量再进行检测。

●根据SDS-PAGE图判断样品中是否存在高丰度蛋白质,高丰度蛋白质会影响样本整体蛋白质鉴定数量。

●有些物种的数据库质量不好,包含的蛋白数目过少,这种可以考虑换大一级的物种分类数据库,或者选择在进化树上同源性较近的、研究比较清楚的、基因组数据库相对完整的模式物种的数据库重新查库。

●样本中有污染或干扰物质,例如常见的有PEG、各种表面活性剂(如SDS、CHAPS、Triton、Tweens、NP-40等),一般在质谱的表现为规律的分子量间隔约44的峰。

●辉骏生物会根据TIC、basepeak图等,判断酶解、仪器状态等是否正常,如果是仪器问题导致的鉴定结果不好,我方会即刻告知客户并安排重复实验。


Q5:LC-MS/MS实验能否提供蛋白质定量信息或确定样品中不同蛋白质的相对含量?

A:我们通常说的质谱鉴定(LC-MS/MS实验)为定性实验,不能做定量分析,但如果您要比较某样本中不同蛋白质的相对含量,可参考蛋白质质谱鉴定结果中的emPAI值(据谱图数、肽段数或肽段得分等来获得的近似定量信息)来大概评估每个蛋白的丰度情况,但这只是粗略估计。

如果您要比较蛋白在多组样本间的相对表达差异,请选择蛋白组组学的方法检测,如label free,iTRAQ,TMT或DIA等,并且通常需要设置样本重复,以便进行统计学分析。


Q6:为什么质谱检测到的蛋白质只是部分氨基酸序列,这样的数据是否可信?

A:质谱鉴定需要先进行蛋白质的酶解,酶解后的肽段再进行质谱分析。蛋白质酶解成肽段的回收率不能达到100%,一定会发生肽段的损失;如果是胶内酶解肽段的回收率会更低一些。

由于蛋白质多种修饰形式的存在,会导致部分序列酶解不完全;或者由于蛋白质的序列特点(酶切位点过于稀疏或者密集),导致酶切后的肽段过小或者过大,都不利于质谱检测。

 根据质谱检测原理,肽段需要被离子化后才能被检测到。由于肽段序列特点,导致某些不容易被离子化的片段很难被检测到。

因此,质谱法鉴定蛋白质的结果一般都只是鉴定到蛋白质的部分序列,即可以达到定性蛋白质的目的。


Q7:质谱结果鉴定到很多蛋白,如何评估蛋白的可信度,或者如果筛选蛋白进行后续研究?

A:辉骏生物提供的鉴定表格中包括了原始蛋白列表和过滤后的蛋白列表,其中过滤后的蛋白列表中为筛选(pep_expect<0.05)后的蛋白,均为可信蛋白。所有蛋白按照得分排序,得分越高的蛋白可信度越高。但要注意,如果您做的是IP,pull down类实验,有意义的蛋白可能由于本身丰度较低而得分低、排名靠后,针对这种情况我们建议您主要依据蛋白功能判断,其次参考得分。


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