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实验简介买此服务

circRNA pull down技术原理


目前,circRNA pull down技术绝大部分是基于接口序列设计探针捕获circRNA及其结合蛋白。由于受限于接口处序列特征,很多circRNA无法设计出理想的探针,最终导致实验失败。 我公司开发了一种新型的circRNA pull down方法,通过构建circRNA过表达载体,使circRNA连上一段16nt的短RNA序列标签(命名为F2),该标签与其特异性配体具有很强的亲和力,因此可利用该系统高效调取靶RNA序列及其结合蛋白。最终通过western blot或LC-MS/MS实验检测洗脱液中靶RNA的潜在结合蛋白,还可通过qPCR实验检测能够结合靶circRNA的miRNA。




circRNA pull-down技术实验流程


circRNA pull down技术实验.bmp






应用领域



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circRNA pull down应用背景


环状RNA(circRNA)是单链共价闭合的RNA分子,广泛存在于各物种中。据报道,circRNA可作为转录调控因子、microRNA海绵和蛋白翻译模板发挥生物学功能,

除此之外,circRNA还可以结合蛋白质来发挥作用,如:


1
与两种蛋白均相互作用,促进或解离它们之间的相互作用。
2

与一种蛋白相互作用,促进或解离其与另一种蛋白的相互作用

 3
与一种蛋白(如转录因子或酶)相互作用,促进或抑制其与靶DNA序列的结合
4


与一种蛋白(如调控mRNA剪接、稳定和翻译的RNA结合蛋白)相互作用,促进或抑制其与其他RNA的结合
5
与一种蛋白相互作用,影响它的胞内运输和定位(如核质转运等),进而影响该蛋白的功能。


以上这些作用模式又不是相互独立的,而是可能存在重叠。

由于蛋白质是几乎所有生命活动的直接效应分子,因此研究circRNA与蛋白的相互作用极大地拓展了我们对circRNA功能的认知。



 



circRNA pull down研究案例-客户文章解析


circRNA pull down研究案例

circRHOT1通过激活NR2F6促进肝细胞癌进程



研究背景

利用在线数据库对肝细胞癌(HCC)组织和癌旁组织的circRNA表达水平分析显示,circRHOT1是在HCC中上调很明显的一种保守性的circRNA,因此作者以circRHOT1为对象研究了其在HCC中的作用机制。



研究路线


1
2

Northern印迹、qRT-PCR、原位杂交等实验确认了circRHOT1在HCC组织中高表达

体内和体外实验证明circRHOT1促进HCC增殖、迁移和侵袭

3
4

RNA-seq等技术分析了circRHOT1缺失后的差异表达基因,其中NR2F6下调最多

CHIRP实验发现circRHOT1富集在NR2F6启动子转录起始位点

5
6

ChIP-qPCR等实验显示敲除circRHOT1影响了NR2F6启动子转录起始位点组蛋白修饰,且RNA聚合酶II不能再结合该启动子,circRHOT1促进NR2F6转录

cicrRNA pull down结合质谱实验发现TP60是circRHOT1的潜在结台蛋白, cicrRNA pull down WB、 RIP-qPCR等实验确定了这一结果

7
8

ChIP和基因表达实验表明circRHOT1对PIP60介导的NR2F6表达至关重要

表达和功能检测发现NR2F6在肿瘤组织中上调,且促进HCC增殖、迁移和侵袭,circRHOT1通过激活NR2F6促进HCC进程




研究结论

circRHOT1通过募集TIP60蛋白到NR2F6启动子来促进其表达,进而促进HCC进程。circRHOT1和NR2F6是HCC预后的潜在生物标志物,但由于在HCC患者中抑制circRHOT1较为困难,因此药理学上抑制NR2F6可能更有希望。



客户文献

Wang L.Y. Circular RNA circRHOT1 promotes hepatocellular carcinoma progression by initiation of NR2F6 expression. Molecular Cancer. 2019. (IF= 27.401).





辉骏实力

辉骏实验外包服务.jpg


辉骏生物提供的circRNA pull down服务分为以下两种:


1. circRNA pulldown WB,用于检测某细胞中的目标circRNA与待测蛋白是否存在相互作用;

2. circRNA pulldown MS,用于筛选某细胞中的目标circRNA与哪些蛋白具有相互作用。


circRNA Pull down检测服务
服务项目服务内容结果交付实验周期客户提供
circRNA pull-down WBcircRNA-F2载体构建和成环检测载体质粒、甘油菌、测序结果、qPCR检测数据、实验报告4周

1、实验样本

2、含有circRNA序列的质粒模板及测序文件

3、待测蛋白抗体

4、实验信息表(样本信息、抗体信息、circRNA和待测蛋白序列)

培养目的细胞、circRNA-F2质粒转染,检测表达效率qPCR检测数据3-4周

circRNA pull down调取目标circRNA及其结合蛋白

(2组:实验组、空载对照组)
circRNA pull down实验报告
5-6周
qPCR评估pull down产物中的circRNA含量qPCR检测数据
circRNA pull-down MSWestern blot检测Pull down产物中的待测蛋白
Western blot检测图4周

1、实验样本

2、含有circRNA序列的质粒模板及测序文件

3、实验信息表(样本信息、circRNA序列)
circRNA-F2载体构建和成环检测载体质粒、甘油菌、测序结果、qPCR检测数据、实验报告3-4周
培养目的细胞、circRNA-F2质粒转染,检测表达效率
qPCR检测数据7-8周

circRNA pull down调取目标circRNA及其结合蛋白

(2组:实验组、空载对照组)
circRNA pull down实验报告
qPCR评估pull down产物中的circRNA含量qPCR检测数据
SDS-PAGE评估pull down产物中的蛋白含量和数量SDS-PAGE银染检测图
LC-MS/MS定性检测pull down产物的蛋白、筛选实验组独有蛋白(潜在互作蛋白)质谱检索表格、互作蛋白筛选表格、检测报告
针对互作蛋白做生物信息学分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息学分析结果和报告
1周



circRNA pull-down服务优势*辉骏生物

1. 该F2亲和纯化系统为辉骏生物自主研发,F2标签与其特异性配体具有非常高的亲和力,保证了该系统能够高效调取circRNA及其结合蛋白,并且捕获特异性更强。

2. 由于F2标签是跨接口设计,只有当形成circRNA时才能保证F2标签的完整性,因此可以有效去除线性基因的背景干扰

3. 不受限于circRNA接口处序列,适用范围更广。

4. circRNA pull down结合质谱的方法能够高通量的筛选与靶circRNA结合的蛋白




circRNA pull down样本要求


1. 送样量要求

样本类型
circRNA pull down建议送样量
动物细胞5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿)


▲注意:这里列出的均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。



2. 样本保存和运输要求:

(1)样本用PBS清洗干净后,离心去掉液体,先放入液氮中速冻,再转移至-80℃冰箱中保存;

(2)样本一定要做好标记,应用油性防冻记号笔或标签纸在管上注明样本名称或编号;

(3)样本较多或需要分批做,要将样本分装;

(4)干冰取样/运输;需要至少在送样前一天通知我方。



 

circRNA pull down结果示例


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circRNA成环检测(qPCR)


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circRNA调取效率检测(qPCR)


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