circRNA pull down * 技术简介
目前,circRNA
pull
down技术绝大部分是基于接口序列设计探针捕获circRNA及其结合蛋白。由于受限于接口处序列特征,很多circRNA无法设计出理想的探针,最终导致实验失败。
我司开发了一种新型的circRNA pull
down方法(已获国家知识产权局发明专利授权,专利号:ZL 2021 1 1160837.9),通过构建circRNA过表达载体,使circRNA连上一段16nt的短RNA序列标签(命名为F2),该标签与其特异性配体具有很强的亲和力,因此可利用该系统高效调取靶RNA序列及其结合蛋白。最终通过western
blot或LC-MS/MS实验检测洗脱液中靶RNA的潜在结合蛋白,还可通过qPCR实验检测能够结合靶circRNA的miRNA。

(图:circRNA pull
down发明专利证书—辉骏生物)
凭借多年RNA和蛋白研究经验,辉骏生物已掌握先进的 circRNA pull-down 技术,帮助您识别 miRNA/RBP 和 circRNA 之间的相互作用。每个项目都是完全定制的,以满足您的科学需求,我们经验丰富的团队可以为您提供灵活的解决方案,以更快的时间和更低的价格给您最可靠的服务。售后技术支持将一直保持到文章发表,确保您安心进行下游实验及投稿。如果您对circRNA pull-down有任何实验问题,请随时与我们联系!
circRNA pull-down * 实验流程

circRNA pull down * 应用背景
环状RNA(circRNA)是单链共价闭合的RNA分子,广泛存在于各物种中。据报道,circRNA可作为转录调控因子、microRNA海绵和蛋白翻译模板发挥生物学功能。
除此之外,circRNA还可以结合蛋白质来发挥作用,如:
与两种蛋白均相互作用,促进或解离它们之间的相互作用。与一种蛋白相互作用,促进或解离其与另一种蛋白的相互作用。
与一种蛋白(如转录因子或酶)相互作用,促进或抑制其与靶DNA序列的结合。与一种蛋白(如调控mRNA剪接、稳定和翻译的RNA结合蛋白)相互作用,促进或抑制其与其他RNA的结合。与一种蛋白相互作用,影响它的胞内运输和定位(如核质转运等),进而影响该蛋白的功能。以上这些作用模式又不是相互独立的,而是可能存在重叠。
由于蛋白质是几乎所有生命活动的直接效应分子,因此研究circRNA与蛋白的相互作用极大地拓展了我们对circRNA功能的认知。
circRNA pull down * 辉骏服务内容
服务项目 | 服务内容 | 结果交付 | 实验周期 | 客户提供 | 价格
|
circRNA pull-down WB (验证型) | circRNA-F2载体构建和成环检测 | 载体质粒及测序结果 qPCR检测结果 构建和检测实验报告 | 3-4周 | 实验样本 circRNA序列的质粒模板 待测蛋白抗体 实验信息表 |
|
circRNA-F2质粒转染目的细胞和表达效率检测 | qPCR检测结果 | 5-7周 |
circRNA pull down调取目标circRNA及其结合蛋白 | circRNA的qPCR检测结果 待测蛋白的Western blot检测图 Pull down实验报告 |
circRNA pull-down MS (筛选型) | circRNA-F2载体构建和成环检测 | 载体质粒及测序结果 qPCR检测结果 构建和检测实验报告 | 3-4周 | 实验样本 circRNA序列的质粒模板 实验信息表 |
|
circRNA-F2质粒转染目的细胞和表达效率检测 | qPCR检测结果 | 7-8周 |
circRNA pull down调取目标circRNA及其结合蛋白 | circRNA的qPCR检测结果
蛋白SDS-PAGE银染检测图 Pull down实验报告 |
LC-MS/MS检测和数据分析 | 质谱检测结果及报告 互作蛋白筛选表格 生物信息学分析结果和报告 |
circRNA pull down * 样本要求
样本类型
| circRNA pull down WB建议送样量 | circRNA pull down MS建议送样量 |
动物细胞
| 3*10e7个细胞/组(约3个10cm皿) | 5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿) |
▲注意:以上均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物索取。
保存及运输:-80℃保存,干冰取样/运输,至少在送样前2天通知我司。
circRNA pull down * 结果示例


circRNA成环检测(qPCR)


circRNA调取效率检测(qPCR)
circRNA pull down * 文章解析
Wang L.Y. Circular RNA circRHOT1 promotes hepatocellular carcinoma progression by initiation of NR2F6 expression.
Molecular Cancer. 2019. (IF= 27.401).
circRHOT1通过激活NR2F6促进肝细胞癌进程
研究概述
利用在线数据库对肝细胞癌(HCC)组织和癌旁组织的circRNA表达水平分析显示,circRHOT1是在HCC中上调很明显的一种保守性的circRNA,因此作者以circRHOT1为对象研究了其在HCC中的作用机制。iegcircRHOT1通过募集TIP60蛋白到NR2F6启动子来促进其表达,进而促进HCC进程。circRHOT1和NR2F6是HCC预后的潜在生物标志物,但由于在HCC患者中抑制circRHOT1较为困难,因此药理学上抑制NR2F6可能更有希望。
研究路线
Northern印迹、qRT-PCR、原位杂交等实验确认了circRHOT1在HCC组织中高表达
体内和体外实验证明circRHOT1促进HCC增殖、迁移和侵袭
RNA-seq等技术分析了circRHOT1缺失后的差异表达基因,其中NR2F6下调最多
CHIRP实验发现circRHOT1富集在NR2F6启动子转录起始位点
ChIP-qPCR等实验显示敲除circRHOT1影响了NR2F6启动子转录起始位点组蛋白修饰,且RNA聚合酶II不能再结合该启动子,circRHOT1促进NR2F6转录
ChIP和基因表达实验表明circRHOT1对PIP60介导的NR2F6表达至关重要
表达和功能检测发现NR2F6在肿瘤组织中上调,且促进HCC增殖、迁移和侵袭,circRHOT1通过激活NR2F6促进HCC进程
circRNA pull-down * 辉骏服务优势
该亲和纯化系统为辉骏生物自主研发,F2与配体具有超强亲和力,能高效调取circRNA及其结合蛋白,且捕获特异性更强。F2标签跨circRNA接口设计,可以有效去除线性基因的背景干扰该pull down系统不受限于circRNA接口处序列,适用范围更广自有分子、细胞、蛋白检测实验平台,能有效指定并执行最优实验路线,对微量蛋白鉴定有十足把控力售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心进行下游实验及投稿
辉骏实力

