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实验简介买此服务

circRNA pull down技术原理


目前,circRNA pull down技术绝大部分是基于接口序列设计探针捕获circRNA及其结合蛋白。由于受限于接口处序列特征,很多circRNA无法设计出理想的探针,最终导致实验失败。 我司开发了一种新型的circRNA pull down方法(已获国家知识产权局发明专利授权,专利号:ZL 2021 1 1160837.9),通过构建circRNA过表达载体,使circRNA连上一段16nt的短RNA序列标签(命名为F2),该标签与其特异性配体具有很强的亲和力,因此可利用该系统高效调取靶RNA序列及其结合蛋白。最终通过western blotLC-MS/MS实验检测洗脱液中靶RNA的潜在结合蛋白,还可通过qPCR实验检测能够结合靶circRNA的miRNA。


circRNA pull down发明专利证书—辉骏生物

(图:circRNA pull down发明专利证书—辉骏生物)


凭借10多年的 RNA 研究经验,辉骏生物已掌握先进的 circRNA pull-down 技术,帮助您识别 miRNA/RBP 和 circRNA 之间的相互作用。每个项目都是完全定制的,以满足您的科学需求,我们经验丰富的团队可以为任何个人要求提供灵活的解决方案,以更快的周转时间和更低的价格向客户保证最可靠和最有效的研究服务。如果您对circRNA pull-down有任何实验问题,请随时与我们联系!

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circRNA pull-down技术实验流程


circRNA pull down技术实验.bmp






应用领域



coip技术服务.bmp






circRNA pull down应用背景


环状RNA(circRNA)是单链共价闭合的RNA分子,广泛存在于各物种中。据报道,circRNA可作为转录调控因子、microRNA海绵和蛋白翻译模板发挥生物学功能。

除此之外,circRNA还可以结合蛋白质来发挥作用,如:


1
与两种蛋白均相互作用,促进或解离它们之间的相互作用。
2

与一种蛋白相互作用,促进或解离其与另一种蛋白的相互作用

 3
与一种蛋白(如转录因子或酶)相互作用,促进或抑制其与靶DNA序列的结合
4


与一种蛋白(如调控mRNA剪接、稳定和翻译的RNA结合蛋白)相互作用,促进或抑制其与其他RNA的结合
5
与一种蛋白相互作用,影响它的胞内运输和定位(如核质转运等),进而影响该蛋白的功能。


以上这些作用模式又不是相互独立的,而是可能存在重叠。

由于蛋白质是几乎所有生命活动的直接效应分子,因此研究circRNA与蛋白的相互作用极大地拓展了我们对circRNA功能的认知。






circRNA pull down研究案例-客户文章解析


circRNA pull down研究案例

circRHOT1通过激活NR2F6促进肝细胞癌进程



研究背景

利用在线数据库对肝细胞癌(HCC)组织和癌旁组织的circRNA表达水平分析显示,circRHOT1是在HCC中上调很明显的一种保守性的circRNA,因此作者以circRHOT1为对象研究了其在HCC中的作用机制。



研究路线


1
2

Northern印迹、qRT-PCR、原位杂交等实验确认了circRHOT1在HCC组织中高表达

体内和体外实验证明circRHOT1促进HCC增殖、迁移和侵袭

3
4

RNA-seq等技术分析了circRHOT1缺失后的差异表达基因,其中NR2F6下调最多

CHIRP实验发现circRHOT1富集在NR2F6启动子转录起始位点

5
6

ChIP-qPCR等实验显示敲除circRHOT1影响了NR2F6启动子转录起始位点组蛋白修饰,且RNA聚合酶II不能再结合该启动子,circRHOT1促进NR2F6转录

cicrRNA pulldown结合质谱实验发现TP60是circRHOT1的潜在结台蛋白, cicrRNA pull down WBRIP-qPCR等实验确定了这一结果

7
8

ChIP和基因表达实验表明circRHOT1对PIP60介导的NR2F6表达至关重要

表达和功能检测发现NR2F6在肿瘤组织中上调,且促进HCC增殖、迁移和侵袭,circRHOT1通过激活NR2F6促进HCC进程




研究结论

circRHOT1通过募集TIP60蛋白到NR2F6启动子来促进其表达,进而促进HCC进程。circRHOT1和NR2F6是HCC预后的潜在生物标志物,但由于在HCC患者中抑制circRHOT1较为困难,因此药理学上抑制NR2F6可能更有希望。



客户文献

Wang L.Y. Circular RNA circRHOT1 promotes hepatocellular carcinoma progression by initiation of NR2F6 expression. Molecular Cancer. 2019. (IF= 27.401).





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辉骏实力

辉骏实验外包服务.jpg


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辉骏生物提供的circRNA pull down服务分为以下两种:


1. circRNA pulldown WB,用于检测某细胞中的目标circRNA与待测蛋白是否存在相互作用;

2. circRNA pulldown MS,用于筛选某细胞中的目标circRNA与哪些蛋白具有相互作用。


circRNA Pull down检测服务
服务项目服务内容结果交付实验周期客户提价格
circRNA pull-down WBcircRNA-F2载体构建和成环检测载体质粒、甘油菌、测序结果、qPCR检测数据、实验报告4周

1、实验样本

2、含有circRNA序列的质粒模板及测序文件

3、待测蛋白抗体

4、实验信息表(样本信息、抗体信息、circRNA和待测蛋白序列)




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培养目的细胞、circRNA-F2质粒转染,检测表达效率qPCR检测数据3-4周

circRNA pull down调取目标circRNA及其结合蛋白

(2组:实验组、空载对照组)
circRNA pull down实验报告
5-6周
qPCR评估pull down产物中的circRNA含量qPCR检测数据
circRNA pull-down MSWestern blot检测Pull down产物中的待测蛋白
Western blot检测图4周

1、实验样本

2、含有circRNA序列的质粒模板及测序文件

3、实验信息表(样本信息、circRNA序列)










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circRNA-F2载体构建和成环检测载体质粒、甘油菌、测序结果、qPCR检测数据、实验报告3-4周
培养目的细胞、circRNA-F2质粒转染,检测表达效率
qPCR检测数据7-8周

circRNA pull down调取目标circRNA及其结合蛋白

(2组:实验组、空载对照组)
circRNA pull down实验报告
qPCR评估pull down产物中的circRNA含量qPCR检测数据
SDS-PAGE评估pull down产物中的蛋白含量和数量SDS-PAGE银染检测图
LC-MS/MS定性检测pull down产物的蛋白、筛选实验组独有蛋白(潜在互作蛋白)质谱检索表格、互作蛋白筛选表格、检测报告
针对互作蛋白做生物信息学分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息学分析结果和报告
1周


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circRNA pull-down服务优势*辉骏生物

1. 该F2亲和纯化系统为辉骏生物自主研发,F2标签与其特异性配体具有非常高的亲和力,保证了该系统能够高效调取circRNA及其结合蛋白,并且捕获特异性更强。

2. 由于F2标签是跨接口设计,只有当形成circRNA时才能保证F2标签的完整性,因此可以有效去除线性基因的背景干扰

3. 不受限于circRNA接口处序列,适用范围更广。

4. circRNA pull down结合质谱的方法能够高通量的筛选与靶circRNA结合的蛋白




circRNA pull down样本要求


1. 送样量要求

样本类型
circRNA pull down建议送样量
动物细胞5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿)


▲注意:这里列出的均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。



2. 样本保存和运输要求:

(1)样本用PBS清洗干净后,离心去掉液体,先放入液氮中速冻,再转移至-80℃冰箱中保存;

(2)样本一定要做好标记,应用油性防冻记号笔或标签纸在管上注明样本名称或编号;

(3)样本较多或需要分批做,要将样本分装;

(4)干冰取样/运输;需要至少在送样前一天通知我方。



 

circRNA pull down结果示例


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circRNA成环检测(qPCR)


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图片.png

circRNA调取效率检测(qPCR)



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