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服务介绍

lncRNA与蛋白互作实验概述


lncRNA (Long non-coding RNA)即长链非编码RNA,通常长度在200-100000 nt,具有5’帽子和3’polyA尾巴结构。

近年来,越来越多的研究聚焦lncRNAs。lncRNA与蛋白质的结合是其重要的调控方式之一,通过与蛋白质的结合,lncRNA参与多种细胞过程。例如:

1

调控该结合蛋白的活性

2

改变该结合蛋白的细胞定位

3

与其他RNA/蛋白竞争结合某蛋白,来调控其他RNA或蛋白的活性

4

结合转录因子,调控基因转录活性

5

招募染色体重构和修饰复合体到特定位点,改变DNA/RNA的修饰状态、染色体结构等




 

lncRNA与蛋白互作服务信息


lncRNA-蛋白互作研究按照实验内容可分为两大类,一是以感兴趣的lncRNA为中心,寻找或验证与该lncRNA结合的蛋白质;二是以感兴趣的蛋白质为中心,寻找或验证与该蛋白质结合的lncRNA。


lncRNA与蛋白互作技术服务
技术类型技术目标技术原理详情
外源性RNA pull-down
体外条件下寻找或验证与目标lncRNA结合的蛋白质

体外转录带有生物素标记的lncRNA,并与样本裂解液孵育,利用链霉亲和素磁珠捕获体外条件下结合的靶RNA-蛋白质复合物,采用Western Blot或质谱技术确定复合物中的蛋白质

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内源性RNA pull-down体内条件下寻找或验证与目标lncRNA结合的蛋白质

将自主研发的特异性RNA标签与目标lncRNA构建融合表达载体,转染细胞使其融合表达,通过与特异性RNA标签结合的亲和介质,将RNA标签-lncRNA与蛋白的复合体纯化出来,采用Western Blot或质谱技术确定复合物中的蛋白质

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RIP体内条件下寻找或验证与目标蛋白质结合的lncRNA

用诱饵蛋白抗体捕获体内条件下的诱饵蛋白与RNA复合物,采用qPCR或高通量测序技术确定与诱饵蛋白结合的lncRNA

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lncRNA与蛋白互作实验服务优势*辉骏生物


1

十年服务经验,客户成果发表在Nature Methods,Oncogene,Cell Research等高水平期刊上。

2

对围绕RNA结合蛋白开展的整体课题提供全方位指导,包括上下游实验设计和结合蛋白的多方法验证等

3

自有蛋白质组学平台,对RNA pull down产物这类微量蛋白的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解

4

售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心进行下游实验及投稿






lncRNA与蛋白互作实验研究案例—客户文章解析


RNA pull down研究案例.png

lncRNA LAMP5-AS1通过调控DOT1L甲基转移酶活性促进MLL白血病发展



研究背景


研究者们通过大量临床样本的检测发现,一个长链非编码RNA(LncRNA)“LAMP5-AS1”在混合系白血病(MLL)中高表达,因此进一步探索了LAMP5-AS1在MLL白血病发生发展中的作用。




研究路线

细胞和小鼠实验确定高表达的LAMP5-AS1促进MLL白血病进展

RNA pull-down结合质谱鉴定技术首次发现了LAMP5-AS1的潜在结合蛋白—DOT1L(一种H3K79甲基转移酶)
RIP qPCR实验确定了LAMP5-AS1与DOT1L结合
截短型 RNA pull down实验进一步明确了与LAMP5-AS1结合的DOT1L结构域
体外酶活实验表明LAMP5-AS1与DOT1L的结合促进了DOT1L的甲基转移酶活性
RNA干扰结合ChIP实验表明LAMP5-AS1影响MLL融合蛋白核心靶基因的H3K79me2/3水平
临床分析LAMP5-AS可作为MLL白血病不良预后的预测因子




研究结论


lncRNA LAMP5-AS1在MLL白血病细胞的自我更新过程和分化阻滞中起着重要的作用。LAMP5-AS1对维持DOT1L酶在MLL白血病中的高活性具有重要意义,可能成为治疗MLL白血病的一个有价值的靶点。





客户文献


Wang W.T. et al: The lncRNA LAMP5-AS1 drives leukemia cell stemness by directly modulating DOT1L methyltransferase activity in MLL leukemia. Journal of Hematology & Oncology. 2020. (IF=17.38






lncRNA与蛋白互作技术服务—客户文章


1. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters.Cell Research.2015, IF=13.9.

【研究内容】:作者通过RNA pull-down、RIP-qPCR、CoIP等技术,证实了lincRNA-p21与HNRNPK结合,并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成复合物。该复合物甲基化了多能性基因的启动子序列及相应组蛋白,并改变了它们的表达量,从而进一步影响体细胞重编程过程。

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2. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods,15(3): 213–220. 2018,IF=28.467.
【研究内容】:辉骏生物为作者单位之一,和客户共同开发了一种全新的RNA pull down,并用质谱鉴定新生RNA结合蛋白的方法。该方法主要是用EU标记新生RNA,再用点击反应-生物素-链霉亲和素系统做RNA-pull down,然后质谱鉴定分离的新生RNA互作蛋白。用该rna pulldown方法,首次鉴定到重要周期蛋白CCK1为RNA结合蛋白。RIP-qPCR、CLIP-Seq等实验进一步证实了CCK1为RBP蛋白,并发挥着重要的细胞。
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3. Wang W.T. et al: The lncRNA LAMP5-AS1 drives leukemia cell stemness by directly modulating DOT1L methyltransferase activity in MLL leukemia. Journal of Hematology & Oncology.2020,IF=11.059.
【研究内容】:研究显示高表达的LncRNA LAMP5-AS1能降低MLL白血病患者5年生存率。利用RNA pull down配合蛋白质质谱鉴定技术,作者首次发现LAMP5-AS1和DOT1L蛋白可能形成复合物。DOT1L是表观遗传中非常重要的甲基化酶。作者通过RIP-qPCR进一步确定了MLL细胞存在该复合物,并通过截短型RNA pull down实验进一步确定了DOT1L的结合序列。后续的ChIP-qPCR等实验证实了该复合物能有效影响DOT1L对组蛋白H3K79的甲基化水平,从而影响细胞的增殖分化。
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4. He S.W. et al: AR-induced long non-coding RNA LINC01503 facilitates proliferation and metastasis via the SFPQ-FOSL1 axis in nasopharyngeal carcinoma. Oncogene. 2020,IF=7.971.
【研究内容】:lncRNA LINC01503在鼻咽癌中高表达,并且促进了肿瘤的不良预后。作者在此探讨了LINC01503的作用机理,先用RNA pull down和质谱鉴定,发现SEPQ蛋白可能和LINC01503结合。RIP-qPCR实验确证了鼻炎癌中LINC01503募集了SEPQ基因。基于SFPQ-FOSL1轴在癌症研究中的重要地位,作者后续的工作思路之一也是关注该信号轴,并设计了CHIP-qPCR等实验做出证明。RNA pull down配合质谱鉴定,为此文研究提供了关键性的研究源头。
使用相关技术lncRNA与蛋白互作技术




辉骏实力

辉骏实验外包服务.jpg




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