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实验简介买此服务

SILAC-IP免疫共沉淀实验原理


在分离纯化诱饵蛋白-互作蛋白复合物过程中,不可避免地会出现非特异结合蛋白,这些蛋白会一并被质谱鉴定出来,成为假阳性的互作蛋白,影响后续挑选验证。 传统的判断假阳性互作蛋白方法是:用诱饵蛋白组鉴定到的蛋白列表,扣除掉对照组鉴定到的蛋白列表,作为“互作蛋白”。但很多真实的互作蛋白,比如丰度比较高的蛋白,在对照组中也会出现,而传统的方法就会被排除掉。

SILAC技术是先将实验组和对照组的蛋白带上不同的同位素,即重链、轻链氨基酸蛋白。复合物分离后,混在同一管中做酶切质谱等。这样既能鉴定到复合物蛋白,又能根据同位素峰强度判断诱饵蛋白组和对照组中蛋白的相对含量,从而更准确地判断出互作蛋白。





SILAC-IP实验技术方案


不同的实验背景和目的需对应用不同方案,辉骏生物提供以下三种SILAC-IP实验方案:



方案一:以野生型细胞株为实验材料


1.分别用轻、重链氨基酸培养细胞,取等量标记好的细胞提取蛋白质;
2.提取的轻链、重链细胞总蛋白分别用Normal IgG和抗bait蛋白的特异抗体做Co-IP;
3.混合轻、重链Co-IP产物;
4.胰酶酶切,LC-MS/MS鉴定和定量蛋白。


SILAC免疫共沉淀技术服务_SILAC-IP_silac ip实验外包公司.jpg


方案二:以过表达诱饵蛋白的细胞株为实验材料


1. 分别用轻、重链氨基酸培养正常对照细胞和过表达诱饵蛋白的细胞株(带标签),取等量标记好的细胞分别提取蛋白质,并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用诱饵蛋白抗体做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鉴定和定量蛋白。

SILAC IP代做_silac ip外包平台.jpg


方案三:以干扰诱饵蛋白的细胞株为实验材料


1. 分别用轻链、重链氨基酸培养RNAi 诱饵蛋白的细胞株和正常对照细胞株,取等量标记好的细胞分别提取蛋白质,并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用诱饵蛋白抗体做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鉴定和定量蛋白。

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应用领域






应用背景


用SILAC结合免疫共沉淀(CoIP)寻找相互作用蛋白是SILAC在定量蛋白质组学研究基础上的进一步应用,称之为SILAC-IP技术。该技术通过质谱鉴定和分析蛋白质相对量来判断是否是特异性结合诱饵蛋白,当实验组与对照组中某个蛋白质量含量达到统计学的差异时,就判定这个蛋白质与诱饵蛋白质具有相互作用。

传统方法在判断假阳性互作蛋白时,很容易将一些在实验组和对照组中同时出现的真实互作蛋白当做假阳性互作蛋白排除掉,SILAC-IP技术将实验组和对照组的蛋白带上不同的同位素,结合质谱分析,既能鉴定到复合物蛋白,又能根据同位素峰强度判断诱饵蛋白组和对照组中蛋白的相对含量,从而更准确地判断出互作蛋白。


相较于传统的免疫共沉淀和pull down技术,SILAC-IP技术特异性强,假阳性极低,通量高,灵敏度高,能直接检测出与bait蛋白互作的其他蛋白的相对含量;适合于可传代细胞,尤其是易转基因细胞





辉骏实力

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SILAC-IP(SILAC标记的免疫共沉淀)服务介绍


SILAC-IP是在SILAC标记细胞中进行Co-IP(免疫共沉淀)的技术。


SILAC-IP(SILAC标记的免疫共沉淀)检测服务
服务项目服务内容结果交付实验周期客户提供
SILAC-IPCo-IP预实验确定抗体拉取效果input和CoIP产物Western blot检测图
2-3周

1、待测细胞及其培养方法

2、诱饵蛋白的IP级抗体

3、实验信息表(样本信息、抗体信息、诱饵蛋白序列)

细胞标记培养(7代以上)并进行标记测试标记测试结果和实验报告
视细胞情况定
Western blot检测SILAC标记细胞(input)中的诱饵蛋白Western blot检测图7-8周
SILAC-IP实验调取诱饵蛋白及其互作蛋白SILAC-IP实验报告
Western blot检测SILAC-IP产物中的诱饵蛋白Western blot检测图
SILAC蛋白定量检测Co-IP产物的蛋白、筛选诱饵蛋白的互作蛋白质谱检索表格、互作蛋白筛选表格、检测报告
针对互作蛋白做生物信息学分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息学分析结果和报告1周




SILAC IP实验服务*辉骏优势


1

近十年服务经验,众多服务案例,服务成果得到优秀期刊认可。

2

对蛋白互作的筛选鉴定理解深刻,擅长针对客户情况提出合适的方案建议

3

自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线

4

自有蛋白质组学平台,对微量互作蛋白的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解

5

售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心进行下游实验及投稿。





SILAC标记的免疫共沉淀实验样本要求


1. 送样要求

样本类型
建议送样量
待测细胞

(广州市内客户)可接受活细胞,2个T25瓶,细胞汇合度>80%;

(其他地区客户)冻存细胞2管。


2. 样本保存和运输要求:

(1)活细胞常温取样;

(2)冻存细胞干冰取样/运输:需要至少在送样前一天通知我方。





silac-ip技术服务结果示例


图片.png

silac ip:质谱检索表格(部分展示)





免疫共沉淀SILAC-IP 客户文献


1. Chen Y.J. et al: Identification of Novel SCIRR69-Interacting Proteins During ER Stress Using SILAC-Immunoprecipitation Quantitative Proteomics Approach. Neuromolecular Med. 2017,IF=2.629.

【研究内容】:为了更好地研究CREB/ATF家族成员SCIRR69在ER应激过程中的功能作用,研究者首先用ER应激激活剂(TG)和衣霉素(TM)处理了SCN和PC12细胞,,qRT-PCR和western结果显示SCIRR69可能在ER应激中起重要作用。采用SILAC IP方法筛选出ER过程中SCIRR69的相互作用蛋白TERA和SFXN1,并通过Co-IP技术验证了它们与SCIRR69的相互作用。研究结果有助于更好地理解SCIRR69在ER应激中的基本功能。

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2. Edward. E. et al Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics. Journal of Visualized Experiments.  2014,IF=1.163.

【研究内容】:每个骨髓瘤患者都有多个亚克隆,具有高或低染色体不稳定性(CIN)特征的多个亚克隆共存会导致异质性和耐药性,导致疾病复发。作者通过串联亲和纯化质谱(TAP-MS)技术,发现了CIN基因NEK2与脱泛素酶USP7结合。该结合阻止了NEK2泛素化并使其稳定。研究发现,使用NEK2或USP7抑制剂进行靶向治疗可能是骨髓瘤最有效的辅助治疗方法。

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