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免疫共沉淀CoIP技术原理


细胞裂解后,孵育结合了抗体的珠子,诱饵蛋白通过其抗体结合到Beads上,同时诱饵蛋白的互作蛋白,也一起“共沉淀”到Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后,再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来,便得到免疫共沉淀CoIP产物。CoIP产物既可用Western Blot检测已知蛋白,也可用质谱鉴定未知蛋白。


当没有合适的诱饵蛋白抗体时,可以通过表达融合了Flag标签的诱饵蛋白,利用Flag标签做免疫沉淀。即细胞过表达Flag-Bait,经裂解后与anti-Flag珠子孵育,诱饵融合蛋白与Beads结合,其互作蛋白“共沉淀”到Beads上,再经洗涤、洗脱后用WB或质谱检测。





免疫共沉淀CoIP实验流程


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内源蛋白抗体免疫共沉淀CoIP实验流程

质谱鉴定_coip免疫共沉淀_Co-IP MS技术实验.jpg

标签抗体免疫共沉淀CoIP实验流程






应用领域



coip技术服务.bmp






Co-IP(免疫共沉淀)应用背景


蛋白质是几乎所有生命活动的直接效应分子,并且在行使功能的时候往往不是单打独斗的,蛋白质之间经常形成复合体,并且在工作过程中还会不断的更换相互作用的伙伴,从而行驶不同的功能。因此,研究蛋白质的相互作用成为研究蛋白质功能和作用机制的最为重要的环节之一。


常见的蛋白相互作用方法主要有免疫共沉淀(Co-IP)、pull down、酵母双杂交、荧光双分子互补(BiFC)、荧光共定位等。


1
Co-IP

Co-IP技术采用目标蛋白的抗体捕获样本中的目标蛋白及其互作蛋白复合物,反应的是体内真实的生理结合,但是不能显示这些相互作用是直接还是间接的;另外合适的免疫共沉淀抗体是决定实验成功的关键,有些蛋白没有可用的IP抗体,无法进行内源性Co-IP实验;通过构建带标签的表达载体,使目标蛋白与标签融合表达,借助标签抗体可以完成Co-IP实验,但需要注意合适的转基因方法又是影响该方法成功的关键。


2
pull down

pull down技术将目标蛋白进行体外原核表达,使标签蛋白(GST或His等)与目标蛋白融合表达,借助标签的亲和介质将目标蛋白纯化出来,可以不受抗体、物种限制,比较轻松的获得目标蛋白的结合蛋白,还可以通过外源同时表达目标蛋白和待测蛋白,确定它们是否发生直接的相互作用,但该方法无法得知体内真实的结合情况。


3
酵母双杂交

酵母双杂交技术是比较古老的一种技术,将目标蛋白和待测蛋白与GAL4 的两个结构域BD和AD融合表达,在酵母细胞中,2个蛋白的结合使得BD和AD在空间上靠近,从而激活报告基因lacZ的表达。但是由于受试蛋白都需要和 AD/BD 结构域形成融合蛋白,空间构象可能改变;另外假阳性率也比较高。


4
荧光双分子互补(BiFC)

荧光双分子互补(BiFC)技术将目标蛋白和待测蛋白分别与GFP的两个片段融合表达,转染细胞后,2个蛋白的结合使得GFP两个片段空间上靠近,从而发出绿色荧光,该技术观测直观,操作简便,但空间分辨率大约 250nm,对于蛋白质相互作用来说依然是个相当远的距离,因此位置上靠近但并未结合的蛋白也可能显示阳性结果,假阳性率较高;另外该技术可以验证蛋白间的相互作用,但不能筛选未知互作蛋白。


5
荧光共定位

荧光共定位技术依靠荧光确定蛋白质具有相同定位,用于辅助证明而非直接证明细胞内蛋白间的相互作用。


以上方法通常相互补充,多种方法共同确定蛋白质间的相互作用,也能更大程度的避免假阳性结果。






Co-IP(免疫共沉淀)研究案例—客户文章解析


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胆固醇通过APMAP抑制EGFR降解诱导前列腺癌细胞转移



研究背景

转移性前列腺癌具有很高的致命性。已有报道表明,胆固醇与前列腺癌的发展有关;前期研究发现,胆固醇可以诱导前列腺癌细胞发生上皮-间质转化(EMT),但其作用及潜在机制尚不清楚。



研究线路

细胞功能实验证实胆醇诱导前列腺癌细胞EMT的发生依赖于ERK1/2的激活
RNA-seq、蛋白组学等实验筛选和验证与胆固醇有关的差异基因和蛋白,确定ERK1/2的上游凋节因子“ APMAI和“"EGFR”作为后续研究目标
APMAP基因敵除后的RNA-seq结果及其细胞实验均显示APMAP和胆固醇可能有相似的功能
APMAP和EGFR的表达关系实验表明 APMAP通过调节EGFR参与胆固醇诱导的EMT过程
Co-IP结合质谱实验找到 APMAP的互作蛋白EPS15R
免疫荧光结果显示胆固醇诱导使EPS15R和APMAP的作用增强,EPS15R与EGFR解离,进而抑制EGFR降解
床样本分析APMAP与前列腺癌的关系




研究结论

本研究证明胆固醇介导APMAP上调,APMAP通过与EGFR竞争结合EPS15R,进而抑制EGFR降解,激活ERK1/2通路,促进前列腺癌细胞EMT;提出APMAP可能是一种关键的调节剂,为高脂肪饮食、肥胖和癌症转移之间提供了联系。


coip研究结论


客户文献

Jiang S.Y. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP. Cancer Research. 2019. (IF=12.701).





辉骏实力

辉骏实验外包服务.jpg


辉骏生物提供的Co-IP免疫共沉淀服务分为以下两种:


1. Co-IP WB,用于检测某样本中的诱饵蛋白和待测蛋白是否存在相互作用;

2. Co-IP MS,用于筛选某样本中的诱饵蛋白与哪些蛋白具有相互作用。


Co-IP(免疫共沉淀)检测服务
服务项目
服务内容结果交付实验周期客户提供
Co-IP WBWestern blot检测样本(input)中的诱饵蛋白和待测蛋白
Western blot检测图4-5周

1、实验样本

2、诱饵蛋白的IP级抗体

3、待测蛋白抗体

4、实验信息表(样本信息、抗体信息、诱饵蛋白和待测蛋白序列)

Co-IP调取诱饵蛋白及其互作蛋白

(2组:实验组、对照组)
Co-IP实验报告
Western blot检测Co-IP产物中的诱饵蛋白和待测蛋白Western blot检测图
Co-IP MS
Western blot检测样本(input)中的诱饵蛋白Western blot检测图7-8周

1、实验样本

2、诱饵蛋白的IP级抗体

3、实验信息表(样本信息、抗体信息、诱饵蛋白序列)

Co-IP调取诱饵蛋白及其互作蛋白

(2组:实验组、对照组)
Co-IP实验报告
Western blot检测Co-IP产物中的诱饵蛋白Western blot检测图
LC-MS/MS定性检测Co-IP产物的蛋白、筛选实验组独有蛋白(潜在互作蛋白)质谱检索表格、互作蛋白筛选表格、检测报告
针对互作蛋白做生物信息学分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息学分析结果和报告
1周




免疫共沉淀CoIP实验*辉骏优势


1. 近十年服务经验,服务客户众多,案例发表在Nature Cell Biology、Nature Plants、Cancer Research等知名期刊上。

2. 对蛋白互作的筛选鉴定理解深刻,擅长针对客户具体情况提出合适的方案建议

3. 自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线

4. 自有蛋白质组学平台,对微量CoIP实验产物的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解

5. 售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心免疫共沉淀下游实验及投稿




CoIP样本要求


1. 送样量要求


样本类型
Co-IP WB建议送样量Co-IP MS建议送样量
动物细胞3*10e7个细胞/组(约3个10cm皿)5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿)
动物组织1g/组2g/组
植物叶片2g/组4g/组
植物根或果实4g/组8g/组
菌体50ul菌体沉淀/组100ul菌体沉淀/组


▲注意:这里列出的均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。



2. 样本保存和运输要求:

(1)样本用PBS清洗干净后,离心去掉液体,先放入液氮中速冻,再转移至-80℃冰箱中保存;

(2)样本一定要做好标记,应用油性防冻记号笔或标签纸在管上注明样本名称或编号;

(3)样本较多或需要分批做,要将样本分装;

(4)干冰取样/运输;需要至少在送样前一天通知我方。




coip实验结果示例


1635214443779892.jpg

Co-IP WB:Western blot检测图(阳性)


图片.png

Co-IP MS:Western blot检测图(阳性)


图片.png

Co-IP MS:质谱检索表格(部分展示)





Co-IP(免疫共沉淀)客户文章


1. Li H.B. et al: The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signaling. Nature Plants. 2019,IF=13.256.
【研究内容】:客户发现,作为内体蛋白分选转运复合体成分之一的FREE1基因,受到脱落酸刺激时候会发生磷酸化并移位到细胞核。客户利用酵母双杂交技术找到两个核蛋白ABF4 and ABI5会与FREE1结合,免疫共沉淀CoIP实验进一步证实了FREE与这两个蛋白的互作。后续实验表明,FREE1通过抑制ABF4、ABI5对下游基因的调控能力,参与了脱落酸信号通路。
使用相关技术:质谱鉴定、免疫共沉淀CoIP、Co-IP MS实验


2. Jiang, S. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP. Cancer Research.2019,IF= 9.727.
【研究内容】:客户利用蛋白质组学技术,筛选出胆固醇致前列腺癌发生上皮间质转变(EMT)的重要基因APMAP和EGFR。通过在前列腺癌细胞表达3*Flag-APMAP基因,并利用免疫共沉淀CoIP及质谱鉴定技术,客户发现EPS15R可与APMAP结合。进一步的研究证实,体内EPS15R-APMAP复合物通过EGFR致使细胞发生EMT。
使用相关技术:蛋白质组学、质谱鉴定、免疫共沉淀CoIP


3. Huang C.Y. et al: UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. 2020 , IF=10.717.
【研究内容】:前期研究表明UBAP2L蛋白参与应激颗粒形成。客户在这项研究中,用免疫共沉淀结合质谱等技术,发现PRMT1甲基化UBAP2L,UBAP2L蛋白并且和另外三个应激颗粒形成有关的重要蛋白有相互作用。这些蛋白复合物介导了应激颗粒的形成。
使用相关技术:CoIP技术服务、质谱鉴定、修饰位点鉴定

 Flag免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒


 货号
 规格
 货期
 FI88801
 10次
 现货
 FI88802 10次 现货
 FI88803 10次 现货
 FI88804 10次 现货










Flag免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒产品简介


辉骏生物的Flag免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒能够高效完成细胞或组织中Flag标签融合的目标蛋白的纯化及其互作蛋白的调取。FLAG-tag由8个氨基酸残基“N-DYKDDDDK-C (1012 Da)”组成,免疫共沉淀实验前,先通过基因工程技术手段将目的基因和FLAG-tag基因序列连接起来,并导入细胞或组织中表达,再用Flag标签免疫共沉淀试剂盒来调取和纯化诱饵蛋白及其互作蛋白。



Flag试剂盒组成


 试剂名称
 体积
 保存条件
 Flag树脂 1mL -20 ℃
 裂解缓冲液(PH 7.4) 50mL 4 ℃
 洗脱缓冲液 1mL -20 ℃



Flag试剂盒产品优势*辉骏生物


1. 抗体与树脂偶联,因此CoIP产物中几乎不含抗体污染,Western Blot或LC-MS检测不受影响;

2. 亲和材料经过特殊优化,与诱饵蛋白结合更多且结合力更强,调取的互作蛋白更多;

3. 操作简便,周期短。



flag试剂盒使用流程简述


1. 将细胞裂解液与Flag树脂,室温下孵育 1-2 小时,或 4 ℃ 过夜;

2. 室温下,漂洗、洗脱得到目标蛋白及其互作蛋白复合物。






 protein G免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒



 货号
 规格
 货期
 FI88805 10次
 现货
 FI88806 20次
 现货





protein G免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒产品简介


辉骏生物的protein G免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒能够高效完成抗原的免疫沉淀( IP)及免疫共沉淀( Co-IP)实验。首先,将特异性的抗体加入样品中与目标抗原形成免疫复合物,然后将其结合在protein G树脂上。通过漂洗去除未结合物质后,用低 pH 的洗脱液将免疫复合物从protein G树脂上洗脱下来。




protein G试剂盒组分


 试剂名称
 体积
 保存条件
 protein G 树脂 1mL 4 ℃
 裂解缓冲液(PH 7.4) 50mL 4 ℃
 洗脱缓冲液(PH 2.0) 1mL 4 ℃



Protein G试剂盒产品优势*辉骏生物


1. 亲和效率高,抗体用量小于 10 μg;

2. 可以用于内源性的目标蛋白免疫沉淀/免疫共沉淀;

3. 操作简便,周期短。




Protein G试剂盒使用流程简述


1. 将细胞裂解液与所选抗体在室温下孵育 1-2 小时,或 4 ℃ 过夜。

2. 在室温下,将抗原/抗体复合物与蛋白G树脂结合 1-2 小时。

3. 漂洗、洗脱得到目标蛋白及其互作蛋白复合物。


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