结合了抗体的磁珠或树脂(Beads)与样本裂解液孵育,通过”抗原-抗体“之间的免疫作用,诱饵蛋白被吸附在Beads上,与此同时,诱饵蛋白的互作蛋白,也一起“共沉淀”到Beads上。洗涤去掉未结合的蛋白后,再用洗脱缓冲液将互作蛋白复合物从Beads上洗脱下来,得到免疫共沉淀(Co-IP)产物。Co-IP产物既可以用Western Blot检测已知蛋白,也可以用质谱鉴定未知蛋白。
当没有合适的诱饵蛋白抗体时,还可以通过表达融合了Flag标签的诱饵蛋白,利用Flag标签抗体做免疫沉淀。即样本过表达Flag-Bait,经裂解后与anti-Flag珠子孵育,诱饵融合蛋白与Beads结合,其互作蛋白“共沉淀”到Beads上,再经洗涤、洗脱后,用WB或质谱检测。
辉骏生物10年科研服务经验,专业提供分子互作实验服务,包括蛋白与蛋白、蛋白与DNA、蛋白与RNA、RNA与RNA的相互作用技术,经验丰富,实验结果稳定、可靠。
我公司自有分子、细胞和质谱实验平台,能执行最优的实验路线,对微量互作蛋白的质谱鉴定有充足把控力,对后续功能分析有独到见解。
我们不仅会提供专业的售前方案建议、而且售后技术支持将一直保持到文章发表,确保您安心进行下游实验及投稿。
目前,客户已在Nature子刊、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功发表大量高分文章(点击查看客户文献)。
内源蛋白抗体免疫共沉淀CoIP实验步骤
标签抗体免疫共沉淀CoIP实验流程
蛋白质之间相互作用是其发挥生物学功能的主要模式,蛋白质会通过结合不同的伙伴来行驶不同的功能,形成复杂的信号转导网络。常见的蛋白互作研究方法主要有:免疫共沉淀(Co-IP)、pull down、酵母双杂交、荧光双分子互补(BiFC)、荧光共定位等。这些方法相互补充,通过多种方法共同验证蛋白质间的相互作用,能更大程度的避免假阳性结果。
Co-IP技术采用抗体捕获样本中的目标蛋白及其互作蛋白复合物,反应的是体内真实的生理结合,但不能显示这些相互作用是直接还是间接的;另外合适的免疫共沉淀抗体是决定实验成功的关键,有些蛋白没有合适的IP抗体,无法进行内源性Co-IP实验;通过构建带标签的表达载体,使目标蛋白与标签融合表达,再借助标签抗体即可完成Co-IP实验,但需要注意合适的转基因方法又是影响该方法成功的关键。
pull down技术将目标蛋白进行体外原核表达,使标签蛋白(GST或His等)与目标蛋白融合表达,借助标签的亲和介质将目标蛋白纯化出来,可以不受抗体、物种限制,比较轻松的获得目标蛋白的结合蛋白,还可以通过外源同时表达目标蛋白和待测蛋白,确定它们是否发生直接的相互作用,但该方法无法得知体内真实的结合情况。
酵母双杂交技术是比较古老的一种技术,将目标蛋白和待测蛋白与GAL4 的两个结构域BD和AD融合表达,在酵母细胞中,2个蛋白的结合使得BD和AD在空间上靠近,从而激活报告基因lacZ的表达。但是由于受试蛋白都需要和 AD/BD 结构域形成融合蛋白,空间构象可能改变;另外假阳性率也比较高。
荧光双分子互补(BiFC)技术将目标蛋白和待测蛋白分别与GFP的两个片段融合表达,转染细胞后,2个蛋白的结合使得GFP两个片段空间上靠近,从而发出绿色荧光,该技术观测直观,操作简便,但空间分辨率大约 250nm,对于蛋白质相互作用来说依然是个相当远的距离,因此位置上靠近但并未结合的蛋白也可能显示阳性结果,假阳性率较高;另外该技术可以验证蛋白间的相互作用,但不能筛选未知互作蛋白。
荧光共定位技术依靠荧光确定蛋白质具有相同定位,用于辅助证明而非直接证明细胞内蛋白间的相互作用。
服务项目 | 服务内容 | 结果交付 | 实验周期 | 客户提供 | 价格 |
Co-IP WB (验证型) | 样本中诱饵蛋白和待测蛋白的Western blot检测 | Western blot检测图 | 4-5周 | 实验样本 诱饵蛋白的IP级抗体 待测蛋白抗体 实验信息表 | |
Co-IP调取诱饵蛋白及其互作蛋白 (2组:实验组、对照组) | CoIP实验报告 诱饵蛋白Western blot检测图 待测蛋白Western blot检测图 | ||||
Co-IP MS (筛选型) | 样本中诱饵蛋白的Western blot检测 | Western blot检测图 | 7-8周 | 实验样本 诱饵蛋白的IP级抗体 实验信息表 | |
Co-IP调取诱饵蛋白及其互作蛋白 (2组:实验组、对照组) | CoIP实验服务报告 诱饵蛋白Western blot检测图 | ||||
LC-MS/MS检测及数据分析 | 质谱检测结果及报 告互作蛋白筛选表格 生物信息学分析结果和报告 |
样本类型 | CoIP 建议送样量 | CoIP 建议送样量 |
动物细胞 | 3*10e7个细胞/组(约3个10cm皿) | 5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿) |
动物组织 | 1g/组 | 2g/组 |
植物叶片 | 2g/组 | 4g/组 |
植物根或果实 | 4g/组 | 8g/组 |
菌体 | 50ul菌体沉淀/组 | 100ul菌体沉淀/组 |
▲注意:这里列出的均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。
保存及运输:-80℃保存,干冰取样/运输,至少在送样前2天通知我司。
Co-IP WB:Western blot检测图(阳性)
Co-IP MS:Western blot检测图(阳性)
Co-IP MS:质谱检索表格(部分展示)
Co-IP MS:互作蛋白生信分析结果(部分展示)
Jiang S.Y. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP.
Cancer Research. 2019. (中科院1区,IF=13.312).
转移性前列腺癌具有很高的致命性。已有报道表明,胆固醇与前列腺癌的发展有关;前期研究发现,胆固醇可以诱导前列腺癌细胞发生上皮-间质转化(EMT),但其作用及潜在机制尚不清楚。本研究证明胆固醇介导APMAP上调,APMAP通过与EGFR竞争结合EPS15R,进而抑制EGFR降解,激活ERK1/2通路,促进前列腺癌细胞EMT;提出APMAP可能是一种关键的调节剂,为高脂肪饮食、肥胖和癌症转移之间提供了联系。
![]() | 1. Li H.B. et al: The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signaling. Nature Plants. 2019,IF=17.352. |
![]() | 2. Jiang, S. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP. Cancer Research.2019,IF= 13.312. |
![]() | 3. Huang C.Y. et al: UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. 2020 , IF=12.067. |
1. 近十年服务经验,服务客户众多,案例发表在Nature Cell Biology、Nature Plants、Cancer Research等知名期刊上。
2. 对蛋白互作的筛选鉴定理解深刻,擅长针对客户具体情况提出合适的方案建议。
3. 自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线。
4. 自有蛋白质组学平台,对微量CoIP实验产物的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解。
5. 售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心免疫共沉淀下游实验及投稿。
辉骏实力
1. Co-IP WB,用于检测某样本中的诱饵蛋白和待测蛋白是否存在相互作用;
2. Co-IP MS,用于筛选某样本中的诱饵蛋白与哪些蛋白具有相互作用。
Co-IP(免疫共沉淀)检测服务 | |||||
服务项目 | 服务内容 | 结果交付 | 实验周期 | 客户提供 | 价格 |
Co-IP WB | Western blot检测样本(input)中的诱饵蛋白和待测蛋白 | Western blot检测图 | 4-5周 | 1、实验样本 2、诱饵蛋白的IP级抗体 3、待测蛋白抗体 4、实验信息表(样本信息、抗体信息、诱饵蛋白和待测蛋白序列) | |
Co-IP调取诱饵蛋白及其互作蛋白 (2组:实验组、对照组) | CoIP实验报告 | ||||
Western blot检测Co-IP产物中的诱饵蛋白和待测蛋白 | Western blot检测图 | ||||
Co-IP MS | Western blot检测样本(input)中的诱饵蛋白 | Western blot检测图 | 7-8周 | 1、实验样本 2、诱饵蛋白的IP级抗体 3、实验信息表(样本信息、抗体信息、诱饵蛋白序列) | |
Co-IP调取诱饵蛋白及其互作蛋白 (2组:实验组、对照组) | CoIP实验服务报告 | ||||
Western blot检测Co-IP产物中的诱饵蛋白 | Western blot检测图 | ||||
LC-MS/MS定性检测Co-IP产物的蛋白、筛选实验组独有蛋白(潜在互作蛋白) | 质谱检索表格、互作蛋白筛选表格、检测报告 | ||||
针对互作蛋白做生物信息学分析(GO、KEGG pathway、String) | 生物信息学分析结果和报告 | 1周 |
1. 近十年服务经验,服务客户众多,案例发表在Nature Cell Biology、Nature Plants、Cancer Research等知名期刊上。
2. 对蛋白互作的筛选鉴定理解深刻,擅长针对客户具体情况提出合适的方案建议。
3. 自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线。
4. 自有蛋白质组学平台,对微量CoIP实验产物的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解。
5. 售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心免疫共沉淀下游实验及投稿。
1. 送样量要求
样本类型 | Co-IP WB建议送样量 | Co-IP MS建议送样量 |
动物细胞 | 3*10e7个细胞/组(约3个10cm皿) | 5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿) |
动物组织 | 1g/组 | 2g/组 |
植物叶片 | 2g/组 | 4g/组 |
植物根或果实 | 4g/组 | 8g/组 |
菌体 | 50ul菌体沉淀/组 | 100ul菌体沉淀/组 |
▲注意:这里列出的均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。
(1)样本用PBS清洗干净后,离心去掉液体,先放入液氮中速冻,再转移至-80℃冰箱中保存;
(2)样本一定要做好标记,应用油性防冻记号笔或标签纸在管上注明样本名称或编号;
(3)样本较多或需要分批做,要将样本分装;
(4)干冰取样/运输;需要至少在送样前一天通知我方。
Co-IP WB:Western blot检测图(阳性)
Co-IP MS:Western blot检测图(阳性)
Co-IP MS:质谱检索表格(部分展示)
![]() | 1. Li H.B. et al: The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signaling. Nature Plants. 2019,IF=17.352. |
![]() | 2. Jiang, S. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP. Cancer Research.2019,IF= 13.312. |
![]() | 3. Huang C.Y. et al: UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. 2020 , IF=12.067. |
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货号 | 规格 | 货期 | 价格 |
FI88801 | 10次 | 现货 | |
FI88802 | 10次 | 现货 | |
FI88803 | 10次 | 现货 | |
FI88804 | 10次 | 现货 |
辉骏生物的Flag免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒能够高效完成细胞或组织中Flag标签融合的目标蛋白的纯化及其互作蛋白的调取。FLAG-tag由8个氨基酸残基“N-DYKDDDDK-C
(1012
Da)”组成,免疫共沉淀实验前,先通过基因工程技术手段将目的基因和FLAG-tag基因序列连接起来,并导入细胞或组织中表达,再用Flag标签免疫共沉淀试剂盒来调取和纯化诱饵蛋白及其互作蛋白。
Flag免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒组成
试剂名称 | 体积 | 保存条件 |
Flag树脂 | 1mL | -20 ℃ |
裂解缓冲液(PH 7.4) | 50mL | 4 ℃ |
洗脱缓冲液 | 1mL | -20 ℃ |
1、抗体与树脂偶联,因此CoIP产物中几乎不含抗体污染,Western Blot或LC-MS检测不受影响;
2、亲和材料经过特殊优化,与诱饵蛋白结合更多且结合力更强,调取的互作蛋白更多;
3、操作简便,周期短。
flag试剂盒使用流程简述
1. 将细胞裂解液与Flag树脂,室温下孵育 1-2 小时,或 4 ℃ 过夜;
2. 室温下,漂洗、洗脱得到目标蛋白及其互作蛋白复合物。
货号 | 规格 | 货期 | 价格 |
FI88805 | 10次 | 现货 | |
FI88806 | 20次 | 现货 |
辉骏生物的protein G免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒能够高效完成抗原的免疫沉淀( IP)及免疫共沉淀( Co-IP)实验。首先,将特异性的抗体加入样品中与目标抗原形成免疫复合物,然后将其结合在protein G树脂上。通过漂洗去除未结合物质后,用低 pH 的洗脱液将免疫复合物从protein G树脂上洗脱下来。
试剂名称 | 体积 | 保存条件 |
protein G 树脂 | 1mL | 4 ℃ |
裂解缓冲液(PH 7.4) | 50mL | 4 ℃ |
洗脱缓冲液(PH 2.0) | 1mL | 4 ℃ |
1、亲和效率高,抗体用量小于 10 μg;
2、可以用于内源性的目标蛋白免疫沉淀/免疫共沉淀;
3、操作简便,周期短。
1. 将细胞裂解液与所选抗体在室温下孵育 1-2 小时,或 4 ℃ 过夜。
2. 在室温下,将抗原/抗体复合物与蛋白G树脂结合 1-2 小时。
3. 漂洗、洗脱得到目标蛋白及其互作蛋白复合物。
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