当前位置:首页 > 科研服务 > 蛋白/核酸相互作用 > DNA-蛋白互作 > DNA pull down
实验简介买此服务

DNA pull down实验原理


先将含脱硫生物素的DNA pulldown探针结合到链霉亲和素Beads上,再将DNA-Beads和细胞裂解液孵育,这样DNA结合蛋白便一起吸附在Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后,再用洗脱液将DNA结合蛋白从Beads洗脱下来,得到DNA pull down产物。DNA-protein复合物既可以用WesternBlot检测已知蛋白,也可以用质谱鉴定未知蛋白。





DNA pull down实验流程


DNA pulldown技术服务、dna pulldown WB实验平台、DNA pull-down MS实验.jpg




应用领域


coip技术服务.bmp





DNA pull-down应用背景


DNA pull-down以感兴趣的DNA序列为中心,寻找与该序列结合的蛋白质,最常见的应用是寻找某特定基因启动子区域的转录因子。


启动子通常位于结构基因5'端上游,含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。


转录因子也称为反式作用因子,是一种DNA结合蛋白,它能够与真核基因的顺式作用元件(如启动子、增强子等)特异性结合来激活或抑制基因表达。转录因子有4个主要结构域:DNA结合域决定了转录因子的特异性,转录调控域(包括激活域或抑制域)决定了转录因子的功能,寡聚化位点使不同转录因子间发生相互作用,核定位信号控制转录因子进入细胞核。


一个基因的启动子通常会结合多种转录因子,寻找启动子序列的特异转录因子,有助于我们理解这些启动子下游的功能基因是如何被调控的。





DNA pulldown技术实验—客户案例


DNA pull down研究案例

lncRNA LAMP5-AS1通过调控DOT1L甲基转移酶活性促进MLL白血病发展



研究背景

鼻咽癌的已有研究指出,氯离子通道-3(CLC-3)是一种有应用前景的癌症生物标志物;但是,CLC-3能否作为胃癌的预后生物标志物以及它在胃癌中的作用机制却鲜有报道。



研究路线

1

免疫组化实验表明CLC-3在胃痦组织中高表达,且与患者不良预后有关

2

RNA-seq分析和细胞实验发现敲除CLC-3抑制细胞增殖和迁移,且影响了PI3K/Akt信号通路的很多基因

3

双荧光素酶实验确定了CLC-3启动子的活性区域

4

DNA pull down MS实验找到了CLC-3启动子活性区域的潜在结合蛋白XRCC5

5

体内DNA探针检测和ChIP-PCR实验都确定了XRCC5蛋白可以结台CLC-3启动子

6

免疫组化实验表明XRCC5和CLC-3的表达呈正相关,且两者高表达指示患者预后不良

7

基因表达/敲除和细胞功能实验结果显示CLC-3的表达和功能受XRCC5的调节

8

CoIP结合质谱实验筛选到了XRCC5的互作蛋白PARP1,体内DNA探针检测发现PARP1也可以与CLC-3启动子结合,XRCC5和PARP1协同调控CLC-3的表达和功能

9

小鼠移植瘤实验表明CLC-3在体内可也以被XRCC5调控,影响肿瘤生长



研究结论

CLC-3过表达是胃癌不良预后的生物标志物,并且CLC-3可能通过PI3K/AKT信号通路调节细胞增殖和迁移。胃癌中CLC-3过表达的调控机制是:XRCC5结合CLC-3启动子区并增加其启动子活性,并且与PARP1相互作用在转录水平正调控CLC-3的表达。



客户文献

Gu Z.Y. et al: Overexpression of CLC-3 is regulated by XRCC5 and is a poor prognostic biomarker for gastric cancer. Journal of Hematology & Oncology. 2018. (IF=17.388).





辉骏实力

辉骏实验外包服务.jpg


辉骏生物提供的DNA pull down服务分为以下两种:

1. DNA Pull down WB,用于检测目标DNA序列与某样本中的待测蛋白是否存在相互作用;

2. DNA Pull down MS,用于筛选目标DNA序列与某样本中的哪些蛋白具有相互作用。

DNA pull down检测服务
服务项目服务内容结果交付实验周期客户提供
DNA pull-down WB制备DNA探针探针电泳图5-6周

1、实验样本

2、含有目标DNA序列的质粒模板及测序文件

3、待测蛋白抗体

4、实验信息表(样本信息、抗体信息、目标DNA和待测蛋白序列)

Western blot检测待测样本中的待测蛋白Western blot检测图

DNA pull down捕获目标DNA片段及其结合蛋白

(2组:实验组、对照组)
RNA pull down实验报告
Western blot检测DNA Pull down产物中的待测蛋白Western blot检测图
DNA pull-down MS
制备DNA探针探针电泳图8-9周

1、实验样本

2、含有目标DNA序列的质粒模板及测序文件

3、实验信息表(样本信息、目标DNA序列)

DNA pull down捕获目标DNA片段及其结合蛋白

(2组:实验组、对照组)
pull down实验报告
SDS-PAGE评估DNA pull down产物中的蛋白含量和数量
SDS-PAGE银染检测图
LC-MS/MS定性检测pull down产物的蛋白、筛选实验组独有蛋白(潜在互作蛋白)质谱检索表格、互作蛋白筛选表格、检测报告
针对互作蛋白做生物信息学分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息学分析结果和报告1周




DNA pull down实验服务优势*辉骏生物


1

十年服务经验,客户成果发表在Nature Methods,Oncogene,Cell Research等高水平期刊上。

2

对围绕DNA结合蛋白开展的整体课题提供全方位指导,包括上下游实验设计和结合蛋白的多方法验证等

3

自有蛋白质组学平台,对dna pull down产物这类微量蛋白的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解

4

售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心进行下游实验及投稿


















DNA pull down样本要求

1. 送样量要求

样本类型DNA pull down WB建议送样量DNA pull down MS建议送样量
动物细胞3*10e7个细胞/组(约3个10cm皿)5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿)
动物组织1g/组2g/组
植物叶片2g/组4g/组
植物根或果实4g/组8g/组
菌体50ul菌体沉淀/组100ul菌体沉淀/组

▲注意:这里列出的均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。

 

2. 样本保存和运输要求

(1)样本用PBS清洗干净后,离心去掉液体,先放入液氮中速冻,再转移至-80℃冰箱中保存;

(2)样本一定要做好标记,应用油性防冻记号笔或标签纸在管上注明样本名称或编号;

(3)样本较多或需要分批做,要将样本分装;

(4)干冰取样/运输;需要至少在送样前一天通知我方。

 



DNA pull-down实验结果示例


图片.png

DNA Pull down ms:SDS-PAGE银染检测图


图片.png

DNA pull down-ms:质谱检索表格(部分展示)





DNA pulldown客户文章


1637896170298984.png Chen R. et al: Lnc-GD2H Promotes Proliferation by Forming a Feedback Loop With c-Myc and Enhances Differentiation Through Interacting With NACA to Upregulate Myog in C2C12 Myoblasts. Front Cell Dev Biol. 2021, IF=6.684.

【研究内容】:本研究通过双荧光素酶,ChIP,DNA pull down和RNA pull down,RIP等实验发现lnc-GD2H在肌肉再生中的作用:在成肌细胞增殖过程中,c-Myc蛋白与lnc-GD2H启动子结合并调节其转录,促进成肌细胞增殖;在成肌细胞分化过程中,lnc-GD2H与成肌细胞分化相关蛋白NACA相互作用,抑制其在Myog启动子的富集,减轻NACA对Myog的抑制作用,促进Myog表达和成肌细胞分化。

使用相关技术:DNA pull down检测、DNA-pull down探针制备实验、DNA pull-down质谱实验服务



1637896170298984.png

 Ma Y. et al: New insights into the proteins interacting with the promoters of silkworm fibroin genes. Scientific Reports. 2021, IF=4.379.

【研究内容】:本研究报道了家蚕中调控丝素蛋白编码基因所必需的启动子相互作用蛋白(PIP),包括丝素重链(Fibre H)、丝素轻链(FiBL)和一个25kD的多肽蛋白(P25)。作者通过DNA pull down结合质谱分析鉴定与FibH、FiBL和P25启动子区域相互作用的蛋白质,研究首次提供了与丝素基因启动子相互作用的蛋白质的深入图谱,有助于更好地理解丝蛋白的合成调控。

使用相关技术:DNA pull-down ms、DNA pulldown技术服务





DNA pull down技术参考文献


1. Wang R.H. et al: A requirement for breast-cancer-associated gene 1(BRCA1) in the spindle checkpoint. PANS. 2004,IF=9.58.
【研究内容】:研究表明BRCA1缺陷型细胞的有丝分裂受到影响,存在纺锤体检查点缺陷。作者检测和纺锤体检查点密切相关的几个基因,发现BRCA1缺陷型Mad2基因表达水平变化明显,由此推测BRCA1是通过影响Mad2的表达,从而影响有丝分裂的。DNA pull down及ChIP-qPCR实验证实了BRCA1可以和Mad2启动子结合,进一步研究发现BRCA1确实上调Mad2的表达,从而影响有丝分裂。
使用相关技术:dna pull down检测、DNA-pull down探针、DNA pull down质谱


2.  Charles E. Foulds.et al: Proteomic Analysis of Coregulators Bound to ERα on DNA and Nucleosomes Reveals Coregulator Dynamics.Mol Cell.2013,IF=15.584.
【研究内容】:转录辅助调节因子(COR)在基因的激活或抑制中起着核心作用,研究者使用生物素-DNA pull down实验和IP结合质谱分析的方法,鉴定与E2配体ERα结合的协同调节子,提取出至少17个转录辅助调节因子。研究发现组蛋白H3K4三甲基标记(H3K4me3)刺激ERα介导转录的机制;H3K4me3模板在ATP和AcCoA存在的情况下促进特定的COR动力学。
使用相关技术DNA pulldown技术服务、DNA pulldown WB、DNA pulldown MS实验

你可能感兴趣的实验

电子邮箱

service@fitgene.com

联系电话

020-32053431 / 400-699-1663

联系地址

广州市黄埔区科学城广州国际企业孵化器D506

微信咨询

微信扫码一对一咨询

服务热线
4006991663
在线客服 返回顶部