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RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RNA结合蛋白免疫沉淀)是研究体内 RNA 与蛋白结合情况的技术,主要包括RIP-qPCR和RIP-seq两种;其中RIP-qPCR用来验证与目标蛋白结合的已知RNA,RIP-seq用来筛选与目标蛋白结合的未知RNA。





RNA免疫沉淀RIP实验原理


细胞裂解后,孵育结合了抗体的珠子,诱饵蛋白通过其抗体结合到Beads上,同时和诱饵蛋白互作的RNA,也一起沉淀到Beads上。洗涤掉未结合的RNA后,再用洗脱液将RNA-蛋白复合物从Beads洗脱下来,便得到RNA免疫沉淀产物。RIP产物既可用qPCR检测已知RNA,也可以二代测序检测未知RNA。


当没有合适的诱饵蛋白抗体时,可以通过表达融合了flag标签的诱饵蛋白,利用flag标签做免疫沉淀。即细胞过表达Flag-Bait,经裂解后与anti-Flag珠子孵育,诱饵融合蛋白与Beads结合,与诱饵融合蛋白互作的RNA“共沉淀”到Beads上,再经洗涤、洗脱后做qPCR或NGS测序。






RNA免疫沉淀RIP实验流程


RIP实验,RNA结合蛋白免疫共沉淀,RIP-seq检测实验.jpg

带标签的RNA免疫共沉淀流程图:

RIP-qPCR,rip技术实验,rip实验外包.jpg






应用领域



coip技术服务.bmp







RIP技术应用背景


RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)是一类功能强大而广泛的调节因子,约占细胞编码的所有蛋白的5%~10%。目前除了少数RNA以核酶形式单独发挥功能,大部分RNA通过与蛋白结合形成RNA-蛋白复合物来发挥作用。


一方面,RBP参与RNA合成、可变剪接、修饰、转运、翻译及胞内定位等多个转录后调控过程,调控mRNA稳定性、lncRNA活性、miRNA沉默复合体形成等生物学过程;另一方面,RNA也会调节这些蛋白质的活性、定位或与其他蛋白质的相互作用,从而影响RBP介导的各种细胞事件。RNA与蛋白质的相互作用对于维持细胞稳态是非常重要的,干扰这种相互作用将会导致细胞功能失调和相关疾病的发生。


目前研究RNA-蛋白质相互作用的方法分为两大类:一是以感兴趣的RNA为中心,寻找与该RNA结合的蛋白质;二是以感兴趣的蛋白质为中心,寻找与该蛋白质结合的RNA。RIP(RNA免疫共沉淀)属于后者,利用特异性的抗体捕获样本中的目标蛋白,那么与目标蛋白结合的RNA也一并被捕获,之后通过qPCR或者测序技术来确定这些结合的RNA。

 




RNA免疫共沉淀RIP实验—客户案例

RIP(RNA免疫共沉淀)研究案例.png

lncRNA PART1通过PLZF介导的EZH2募集导致PDGFB表观遗传沉默来抑制侵袭性胃癌



研究背景


目前的研究显示,一种长链非编码RNA(LncRNA)“PART1”在某些癌症中有抑癌作用,在某些癌症中又有致癌作用。人类胃癌组织的GEO芯片数据显示,lncRNA PART1在胃癌中显著下调,TCGA数据库和GEPIA数据库信息显示低水平的lncRNA PART1更容易导致肿瘤转移和患者生存期缩短;但其临床意义和潜在机制尚未明确。



研究路线


细胞、CAM和小鼠实验均表明PART1水平与胃癌的恶性程度、转移能力呈负相关
RNA-seq实验发现高表达的PART1下调了PI3K-Akt通路的一些基因,上调了肿瘤抑制基因PLZF,肿瘤组织检测和TCGA数据库资料确定了该结果
RNA pull-down结合质谱鉴走技术首次发现了PART1的潜在结合蛋白——AR(已有研究表明AR可以激活前列腺瘟中的PLZF并抑制其增殖
RNA pull down WB和 RIP qPCR实验确定了PART1与AR的相互作用
ChIP和双荧光素酶实验表明AR与PLZF启动子的2个位点结合,PLZF启动子因AR、PART1的单独作用或两者的协同作用而激活
数据库调查和Co-IP结果均显示PIZF蛋白与EZH2蛋白结合
ChIP-qPCR结果表明PI3K-Akt通路蛋白PDGFB的启动子与PIZF、EZH2蛋白结合、且该区域发生H3K27me3修饰

功能回复实验表明, PDGFB过表达可以部分回复PART1对GC细胞生长、迁移和侵袭、等能力的抑制




研究结论

lncRNA PART1是胃癌的肿瘤抑制因子,可以作为GC转移和预后的预测因子。新发现的PART1作用机制是:PART1与AR相互作用,以雄激素非依赖性的模式激活肿瘤抑制因子PLZF,之后PLZF蛋白和EZH2蛋白相互作用,导致PI3K-Akt通路基因PDGFB的启动子发生H3K27me3修饰,从而使促癌基因PDGFB的转录活性受到抑制。




客户文献

Han H. et al: Long noncoding RNA PART1 restrains aggressive gastric cancer through the epigenetic silencing of PDGFB via the PLZF-mediated recruitment of EZH2. Oncogene. 2020. (IF=9.867)






辉骏实力

辉骏实验外包服务.jpg





辉骏生物提供的RIP(RNA免疫共沉淀)服务分为以下两种


1. RIP-qPCR,用于检测某样本中的诱饵蛋白和待测RNA是否结合;

2. RIP-seq,用于筛选某样本中的诱饵蛋白可以结合哪些RNA。


RIP(RNA免疫共沉淀)检测服务
服务项目
服务内容结果交付实验周期客户提供
RIP qPCRWestern blot检测样本(input)中的诱饵蛋白Western blot检测图5-6周

实验样本

诱饵蛋白的IP级抗体

实验信息表(样本信息,诱饵蛋白及待测RNA序列)

RIP调取诱饵蛋白及其结合的RNA

(2组:实验组和对照组)
RIP实验报告
Western blot检测RIP产物中的诱饵蛋白Western blot检测图
qPCR检测RIP产物中的待测RNAqPCR检测数据
RIP seqWestern blot检测样本(input)中的诱饵蛋白Western blot检测图5-6周

实验样本

诱饵蛋白的IP级抗体

实验信息表(样本信息,诱饵蛋白序列)

RIP调取诱饵蛋白及其结合的RNA

(2组:实验组和对照组)
RIP实验报告
Western blot检测RIP产物中的诱饵蛋白
Western blot检测图
seq检测ChIP产物中的RNA并分析seq检测结果、检测和分析报告9周




RIP(RNA免疫共沉淀)服务优势*辉骏生物


1

十年服务经验,众多服务案例,服务成果得到优秀期刊认可

2

可对围绕RNA结合蛋白开展的整体课题提供全方位方案建议

3

自有分子及细胞生物实验平台,能有效制定并执行最优的实验路线

4

自有蛋白质组学平台,对微量互作蛋白的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解




RIP(RNA免疫共沉淀)样本要求


1. 送样量要求


样本类型
样本类型RIP seq建议送样量
动物细胞
3*10e7个细胞/组(约3个10cm皿)5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿)
动物组织1g/组1g/组

▲注意:这里列出的均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。



2. 样本保存和运输要求:

(1)样本用PBS清洗干净后,离心去掉液体,先放入液氮中速冻,再转移至-80℃冰箱中保存;

(2)样本一定要做好标记,应用油性防冻记号笔或标签纸在管上注明样本名称或编号;

(3)样本较多或需要分批做,要将样本分装;

(4)干冰取样/运输;需要至少在送样前一天通知我方。

 



RNA免疫共沉淀RIP结果示例


图片.png

rip qPCR检测数据


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RIP组相对于input组的富集图(% input)


图片.png

RIP组相对于IgG组的富集图





RIP技术实验客户文章


1. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA.Nature Methods,15(3): 213–220. 2018,IF=28.467.
【研究内容】:辉骏生物为作者单位之一,和作者共同开发了一种捕获鉴定新生RNA结合蛋白的全新方法(RICK)。该方法用EU标记新生RNA,通过点击反应-生物素-链霉亲和素系统结合质谱分析,分离鉴定RNA互作蛋白。其中,METTL1和CDK1是两个RICK独有的RNA结合蛋白。 RIP-qPCR、RIP-Seq、CLIP-Seq等实验进一步证实了它们与非PolyA RNA的结合,这种结合在细胞分化与增殖中发挥了重要作用。
使用相关技术RIP-qPCR、RNA免疫共沉淀RIP-Seq、RNA结合蛋白免疫沉淀技术


2. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Research.2015, IF=13.9.

【研究内容】:客户利用RNA pull down、CoIP等技术,发现lincRNA-p21与HNRNPK结合,并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成复合物,作者通过RIP-qPCR进一步证实了细胞中存在该复合物。该复合物甲基化了多能性基因的启动子序列及相应组蛋白,并改变了它们的表达量,从而进一步影响体细胞重编程过程。

使用相关技术RIP seq、RNA结合蛋白疫共沉淀rip qpcr、质谱鉴定

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