RNA免疫沉淀（RIP）* 实验原理

RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RNA结合蛋白免疫沉淀）是研究体内 RNA 与蛋白结合情况的技术。

结合了抗体的磁珠或树脂（Beads）与样本裂解液孵育，通过”抗原-抗体“之间的免疫作用，诱饵蛋白被吸附在Beads上，与诱饵蛋白结合的RNA，也一起沉淀到Beads上。洗涤去掉未结合的RNA后，再用洗脱液将RNA-蛋白复合物从Beads洗脱下来，便得到RNA免疫沉淀产物。RIP产物既可以用qPCR检测已知RNA，也可以用二代测序检测未知RNA。

当没有合适的诱饵蛋白抗体时，可以通过表达融合了flag标签的诱饵蛋白，利用flag标签做免疫沉淀。即细胞过表达Flag-Bait，经裂解后与anti-Flag珠子孵育，诱饵融合蛋白与Beads结合，与诱饵融合蛋白互作的RNA“共沉淀”到Beads上，再经洗涤、洗脱后做qPCR或NGS测序。

RNA免疫沉淀（RIP）* 实验流程

内源蛋白的RNA免疫共沉淀流程图

标签融合蛋白的RNA免疫共沉淀流程图

RNA免疫共沉淀（RIP）* 应用背景

RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一类功能强大而广泛的调节因子，约占细胞编码的所有蛋白的5%~10%。目前除了少数RNA以核酶形式单独发挥功能，大部分RNA通过与蛋白结合形成RNA-蛋白复合物来发挥作用。

一方面，RBP参与RNA合成、可变剪接、修饰、转运、翻译及胞内定位等多个转录后调控过程，调控mRNA稳定性、lncRNA活性、miRNA沉默复合体形成等生物学过程；另一方面，RNA也会调节这些蛋白质的活性、定位或与其他蛋白质的相互作用，从而影响RBP介导的各种细胞事件。RNA与蛋白质的相互作用对于维持细胞稳态是非常重要的，干扰这种相互作用将会导致细胞功能失调和相关疾病的发生。

目前研究RNA-蛋白质相互作用的方法分为两大类：一是以感兴趣的RNA为中心，寻找与该RNA结合的蛋白质；二是以感兴趣的蛋白质为中心，寻找与该蛋白质结合的RNA。RIP（RNA免疫共沉淀）属于后者，利用特异性的抗体捕获样本中的目标蛋白，那么与目标蛋白结合的RNA也一并被捕获，之后通过qPCR或者测序技术来确定这些结合的RNA。

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RNA免疫共沉淀（RIP）* 辉骏服务内容

RNA免疫共沉淀RIP * 样本要求

▲注意：这里列出的均为每组样本的送样量，如果实验和对照组用的样本一致，此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。

 保存及运输：-80℃保存，干冰取样/运输，至少在送样前2天通知我司。

RNA免疫共沉淀RIP * 结果示例

RIP-qPCR：诱饵蛋白western blot检测图

RIP-qPCR：待测基因和内参基因检测数据

RIP组相对于IgG组的富集图

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RNA免疫共沉淀RIP * 客户服务案例

Han H. et al: Long noncoding RNA PART1 restrains aggressive gastric cancer through the epigenetic silencing of PDGFB via the PLZF-mediated recruitment of EZH2. 

Oncogene. 2020. (IF=9.867)

lncRNA PART1通过PLZF介导的EZH2募集导致PDGFB表观遗传沉默来抑制侵袭性胃癌

研究概述

以往研究显示，一种长链非编码RNA(LncRNA)“PART1”在某些癌症中有抑癌作用，在某些癌症中又有致癌作用。人类胃癌组织的GEO芯片数据显示，lncRNA PART1在胃癌中显著下调，TCGA数据库和GEPIA数据库信息显示低水平的lncRNA PART1更容易导致肿瘤转移和患者生存期缩短；但其临床意义和潜在机制尚未明确。本研究发现的PART1新作用机制是：PART1与AR相互作用，以雄激素非依赖性的模式激活肿瘤抑制因子PLZF，之后PLZF蛋白和EZH2蛋白相互作用，导致PI3K-Akt通路基因PDGFB的启动子发生H3K27me3修饰，从而使促癌基因PDGFB的转录活性受到抑制。

研究路线

RNA免疫共沉淀RIP * 客户文章

1. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA.Nature Methods,15(3): 213–220. 2018，IF=28.467. 【研究内容】：辉骏生物为作者单位之一，和作者共同开发了一种捕获鉴定新生RNA结合蛋白的全新方法（RICK）。该方法用EU标记新生RNA，通过点击反应-生物素-链霉亲和素系统结合质谱分析，分离鉴定RNA互作蛋白。其中，METTL1和CDK1是两个RICK独有的RNA结合蛋白。 RIP-qPCR、RIP-Seq、CLIP-Seq等实验进一步证实了它们与非PolyA RNA的结合，这种结合在细胞分化与增殖中发挥了重要作用。 使用相关技术：RIP-qPCR、RNA免疫共沉淀RIP-Seq、RNA结合蛋白免疫沉淀技术

2. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Research.2015, IF=13.9. 【研究内容】：客户利用RNA pull down、CoIP等技术，发现lincRNA-p21与HNRNPK结合，并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成复合物，作者通过RIP-qPCR进一步证实了细胞中存在该复合物。该复合物甲基化了多能性基因的启动子序列及相应组蛋白，并改变了它们的表达量，从而进一步影响体细胞重编程过程。 使用相关技术：RIP seq、RNA结合蛋白免疫共沉淀rip qpcr、质谱鉴定

3. Zhang C Y . et al: CircVPRBP inhibits nodal metastasis of cervical cancer by impeding RACK1 O-GlcNAcylation and stability. Oncogene. 2023, IF=8.756. 【研究内容】：淋巴结转移是宫颈癌（CCa）患者最恶性的临床特征之一。本研究利用RNA pull down、RIP和Co-IP等实验发现：circVPRBP与OGT酶竞争结合RACK1蛋白，阻碍RACK1-S122位点的O-GlcNAc修饰来使其降解，从而抑制宫颈癌淋巴结转移和淋巴管生成。 使用相关技术：RIP-qPCR、RNA pull down MS、免疫共沉淀Co-IP、质谱鉴定

辉骏生物RIP（RNA免疫共沉淀）服务内容

1. RIP-qPCR，用于检测某样本中的诱饵蛋白和待测RNA是否结合；

2. RIP-seq，用于筛选某样本中的诱饵蛋白可以结合哪些RNA。

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RIP（RNA免疫共沉淀）样本要求

▲注意：这里列出的均为每组样本的送样量，如果实验和对照组用的样本一致，此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。

保存及运输：-80℃保存，干冰取样/运输，至少在送样前2天通知我司。

RNA免疫共沉淀RIP结果示例

RIP qPCR检测数据

RIP组相对于input组的富集图（% input）

RIP组相对于IgG组的富集图

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RIP（RNA免疫共沉淀）服务优势*辉骏生物

RIP实验客户文章

1. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA.Nature Methods,15(3): 213–220. 2018，IF=28.467. 【研究内容】：辉骏生物为作者单位之一，和作者共同开发了一种捕获鉴定新生RNA结合蛋白的全新方法（RICK）。该方法用EU标记新生RNA，通过点击反应-生物素-链霉亲和素系统结合质谱分析，分离鉴定RNA互作蛋白。其中，METTL1和CDK1是两个RICK独有的RNA结合蛋白。 RIP-qPCR、RIP-Seq、CLIP-Seq等实验进一步证实了它们与非PolyA RNA的结合，这种结合在细胞分化与增殖中发挥了重要作用。 使用相关技术：RIP-qPCR、RNA免疫共沉淀RIP-Seq、RNA结合蛋白免疫沉淀技术

2. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Research.2015, IF=13.9. 【研究内容】：客户利用RNA pull down、CoIP等技术，发现lincRNA-p21与HNRNPK结合，并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成复合物，作者通过RIP-qPCR进一步证实了细胞中存在该复合物。该复合物甲基化了多能性基因的启动子序列及相应组蛋白，并改变了它们的表达量，从而进一步影响体细胞重编程过程。 使用相关技术：RIP seq、RNA结合蛋白免疫共沉淀rip qpcr、质谱鉴定

3. Zhang C Y . et al: CircVPRBP inhibits nodal metastasis of cervical cancer by impeding RACK1 O-GlcNAcylation and stability. Oncogene. 2023, IF=8.756. 【研究内容】：淋巴结转移是宫颈癌（CCa）患者最恶性的临床特征之一。本研究利用RNA pull down、RIP和Co-IP等实验发现：circVPRBP与OGT酶竞争结合RACK1蛋白，阻碍RACK1-S122位点的O-GlcNAc修饰来使其降解，从而抑制宫颈癌淋巴结转移和淋巴管生成。 使用相关技术：RIP-qPCR、RNA pull down MS、免疫共沉淀Co-IP、质谱鉴定

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RNA免疫共沉淀试剂盒（RIP试剂盒）信息

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RIP试剂盒简介

RNA免疫共沉淀（RIP）是采用特异性抗体来调取内源性RNA结合蛋白及其结合RNA的技术。分离出的蛋白可以进行western-blot检测调取效果，而提取纯化的RNA可以利用qPCR（RIP-qPCR）或利用高通量测序（RIP-Seq）方法来检测。

根据样本类型、诱饵蛋白是否携带标签，以及beads类型不同，辉骏生物公司开发了多款RIP试剂盒，可用于分离不同生物样本提取物中的目标蛋白及其结合RNA。

当诱饵蛋白不带标签时，可以根据beads的不同选择protein G 或Protein A/G RIP试剂盒，当诱饵蛋白携带标签时，可以根据标签种类的不同选择ChainFree^TM 系列试剂盒，该系列试剂盒采用了优化并重组表达的、无轻重链的标签抗体磁珠进行RIP实验。IP复合物无论采用非变性洗脱还是变性洗脱，均不会出现抗体的轻、重链污染问题。

RIP试剂盒应用

RNA结合蛋白（RBPs）是可以与RNA结合的蛋白质，参与调控了RNA的众多生物学过程。可以说，没有RBPs，RNA几乎寸步难行。RIP技术主要应用于验证或寻找与已知RBP结合的RNA。以下列举了可应用RIP试剂盒的几个研究方向：

1. RBPs功能研究，如活性调控、定位等；

2. RBPs调控的RNA功能研究，如合成、可变剪切、修饰、转运、定位、稳定性和翻译等。

Protein G和ProteinA/G RIP试剂盒-辉骏生物产品优势

1、特殊优化的beads与抗体亲和效率高，抗体用量少；

2、裂解效率高：优化的各裂解液体系分别适用于动物、植物或微生物样本；

3、操作简便，周期短，适合初学者。

4、品质好，实验结果稳定。

5、洗脱液适配后续qPCR和高通量测序实验。