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RNA pull down实验原理


先将体外转录的RNA结合到Beads上,再将RNA-Beads和细胞裂解液孵育,这样与目标RNA结合的蛋白便会一起吸附在Beads上。洗涤掉不结合的蛋白后,用洗脱液将RNA-protein复合物从Beads洗脱下来,之后可以采用Western Blot技术检测特定的结合蛋白,还可以采用质谱方法鉴定与目标RNA结合的未知蛋白。


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RNA pull down实验原画步骤流程


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应用领域



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RNA pull down应用背景


RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)是一类功能强大而广泛的调节因子,约占细胞编码的所有蛋白的5%~10%。目前除了少数RNA以核酶形式单独发挥功能,大部分RNA通过与蛋白结合形成RNA-蛋白复合物来发挥作用。  


一方面,RBP参与RNA合成、可变剪接、修饰、转运、翻译及胞内定位等多个转录后调控过程,调控mRNA稳定性、lncRNA活性、miRNA沉默复合体形成等生物学过程;另一方面,RNA也会调节这些蛋白质的活性、定位或与其他蛋白质相互作用,从而影响RBP介导的各种细胞事件。RNA与蛋白质的相互作用对于维持细胞稳态是非常重要的,干扰这种相互作用将会导致细胞功能失调和相关疾病的发生。  


目前研究RNA-蛋白质相互作用的方法分为两大类:一是以感兴趣的RNA为中心,寻找与该RNA结合的蛋白质;二是以感兴趣的蛋白质为中心,寻找与该蛋白质结合的RNA。RNA pull down属于前者,通过体外转录的方式将感兴趣的RNA带上标签,通过该标签使RNA结合到树脂支持物上,再加入样本蛋白质与RNA结合,洗涤、洗脱得到与目标RNA结合的蛋白质。





RNA pull-down 实验服务研究案例—客户文章解析


RNA pull down实验外包技术服务结果

lncRNA LAMP5-AS1通过调控DOT1L甲基转移酶活性促进MLL白血病发展



研究背景


研究者们通过大量临床样本的检测发现,一个长链非编码RNA(LncRNA)“LAMP5-AS1”在混合系白血病(MLL)中高表达,因此进一步探索了LAMP5-AS1在MLL白血病发生发展中的作用。




研究路线


细胞和小鼠实验确定高表达的LAMP5-AS1促进MLL白血病进展
RNA pull-down结合质谱鉴定技术首次发现了LAMP5-AS1的潜在结合蛋白—DOT1L(一种H3K79甲基转移酶)
RIP qPCR实验确定了LAMP5-AS1与DOT1L结合
截短型 RNA pull down实验进一步明确了与LAMP5-AS1结合的DOT1L结构域
体外酶活实验表明LAMP5-AS1与DOT1L的结合促进了DOT1L的甲基转移酶活性
RNA干扰结合ChIP实验表明LAMP5-AS1影响MLL融合蛋白核心靶基因的H3K79me2/3水平
临床分析LAMP5-AS可作为MLL白血病不良预后的预测因子



研究结论


lncRNA LAMP5-AS1在MLL白血病细胞的自我更新过程和分化阻滞中起着重要的作用。LAMP5-AS1对维持DOT1L酶在MLL白血病中的高活性具有重要意义,可能成为治疗MLL白血病的一个有价值的靶点。



客户文献


Wang W.T. et al: The lncRNA LAMP5-AS1 drives leukemia cell stemness by directly modulating DOT1L methyltransferase activity in MLL leukemia. Journal of Hematology & Oncology. 2020. (IF=17.388)





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辉骏生物RNA-pull down实验技术服务分以下两种:


1. RNA pull down WB,用于检测目标RNA与某样本中的待测蛋白是否存在相互作用;

2. RNA pull down MS,用于筛选目标RNA与某样本中的哪些蛋白具有相互作用。


RNA Pull down检测服务
服务项目服务内容结果交付实验周期客户提价格
RNA pull down WB制备RNA正义链和反义链探针探针电泳图5-6周

1、实验样本

2、含有目标基因序列的质粒模板及测序文件

3、待测蛋白抗体

4、实验信息表(样本信息、抗体信息、目标RNA和待测蛋白序列)



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Western blot检测待测样本中的待测蛋白Western blot检测图

RNA pull down捕获目标RNA及其结合蛋白

(2组:正义链孵育组、反义链孵育组)
RNA pull down实验报告
Western blot检测RNA Pull down产物中的待测蛋白Western blot检测图
RNA pull down MS制备RNA正义链和反义链探针探针电泳图8-9周

1、实验样本

2、含有目标基因序列的质粒模板及测序文件

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针对互作蛋白做生物信息学分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息学分析结果和报告1周


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RNA pull-down服务优势*辉骏生物


1

十年服务经验,客户成果发表在Nature Methods,Oncogene,Cell Research等高水平期刊上。

2

对围绕RNA结合蛋白开展的整体课题提供全方位指导,包括上下游实验设计和结合蛋白的多方法验证等

3

自有蛋白质组学平台,对RNA pull down产物这类微量蛋白的质谱鉴定有十足的把控能力,对后续的生物信息分析有独到的见解

4

售后技术支持将一直保持到客户发表文章,确保客户安心进行下游实验及投稿




RNA pulldown实验外包服务样本要求


1. 送样量要求

样本类型
RNA pull down WB建议送样量RNA pull down MS建议送样量
动物细胞
3*10e7个细胞/组(约3个10cm皿)5*10e7个细胞/组(约5个10cm皿)
动物组织1g/组2g/组
植物叶片2g/组4g/组
植物根或果实4g/组8g/组
菌体50ul菌体沉淀/组100ul菌体沉淀/组


▲注意:这里列出的均为每组样本的送样量,如果实验和对照组用的样本一致,此样本量*2。详细送样指南可联系辉骏生物客服或销售索取。

 

2. 样本保存和运输要求:

(1)样本用PBS清洗干净后,离心去掉液体,先放入液氮中速冻,再转移至-80℃冰箱中保存;

(2)样本一定要做好标记,应用油性防冻记号笔或标签纸在管上注明样本名称或编号;

(3)样本较多或需要分批做,要将样本分装;

(4)干冰取样/运输;需要至少在送样前一天通知我方。






RNA pull down实验结果示例


RNA pull down实验技术服务结果

RNA pulldown WB:Western blot检测图(阳性)


RNA pull down实验结果条带怎么看

RNA pull-down MS:SDS-PAGE银染检测图


RNA pull-down实验原理和步骤及结果分析

RNA pull down-MS:质谱检索表格(部分展示)






RNA pull-down实验技术服务客户文章


1. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters.Cell Research.2015, IF=13.9.

【研究内容】:作者通过RNA pull-down、RIP-qPCR、CoIP等技术,证实了lincRNA-p21与HNRNPK结合,并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成复合物。该复合物甲基化了多能性基因的启动子序列及相应组蛋白,并改变了它们的表达量,从而进一步影响体细胞重编程过程。

使用相关技术:rna pull-down、RNA-蛋白相互作用


2. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods,15(3): 213–220. 2018,IF=28.467.
【研究内容】:辉骏生物为作者单位之一,和客户共同开发了一种全新的RNA pull down,并用质谱鉴定新生RNA结合蛋白的方法。该方法主要是用EU标记新生RNA,再用点击反应-生物素-链霉亲和素系统做RNA-pull down,然后质谱鉴定分离的新生RNA互作蛋白。用该rna pulldown方法,首次鉴定到重要周期蛋白CCK1为RNA结合蛋白。RIP-qPCR、CLIP-Seq等实验进一步证实了CCK1为RBP蛋白,并发挥着重要的细胞。
使用相关技术:RNA pull down WB、RNA pull-down 技术服务


3. Wang W.T. et al: The lncRNA LAMP5-AS1 drives leukemia cell stemness by directly modulating DOT1L methyltransferase activity in MLL leukemia. Journal of Hematology & Oncology.2020,IF=11.059.
【研究内容】:研究显示高表达的LncRNA LAMP5-AS1能降低MLL白血病患者5年生存率。利用RNA pull down配合蛋白质质谱鉴定技术,作者首次发现LAMP5-AS1和DOT1L蛋白可能形成复合物。DOT1L是表观遗传中非常重要的甲基化酶。作者通过RIP-qPCR进一步确定了MLL细胞存在该复合物,并通过截短型RNA pull down实验进一步确定了DOT1L的结合序列。后续的ChIP-qPCR等实验证实了该复合物能有效影响DOT1L对组蛋白H3K79的甲基化水平,从而影响细胞的增殖分化。
使用相关技术:rna pulldown实验、rna pull down ms、rna pulldown探针


4. He S.W. et al: AR-induced long non-coding RNA LINC01503 facilitates proliferation and metastasis via the SFPQ-FOSL1 axis in nasopharyngeal carcinoma. Oncogene. 2020,IF=7.971.
【研究内容】:lncRNA LINC01503在鼻咽癌中高表达,并且促进了肿瘤的不良预后。作者在此探讨了LINC01503的作用机理,先用RNA pull down和质谱鉴定,发现SEPQ蛋白可能和LINC01503结合。RIP-qPCR实验确证了鼻炎癌中LINC01503募集了SEPQ基因。基于SFPQ-FOSL1轴在癌症研究中的重要地位,作者后续的工作思路之一也是关注该信号轴,并设计了CHIP-qPCR等实验做出证明。RNA pull down配合质谱鉴定,为此文研究提供了关键性的研究源头。
使用相关技术RNA pulldown实验、rna-pull down 打质谱


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RNA Pull-down试剂盒产品简介


辉骏生物自主研发的RNA pulldown 试剂盒能够利用一段特殊的RNA标签与其特异性配体的强亲和力来高效调取目标RNA序列及其结合蛋白。RNA标签与目标RNA序列融合后作为探针,固定在磁珠上的亲和配体捕获该融合RNA,再与待测蛋白液孵育,即可调取目标RNA的结合蛋白。





RNA pull down试剂盒产品优势*辉骏生物

1、该RNA标签可以连接和标记各种类型的RNA;
2、可以用于体内或体外标记目标RNA;
3、标签与其特异性配体的强亲和力能够高效调取目标RNA及其结合蛋白。

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