ChIP-qPCR检测到DNA富集，就能证明蛋白直接结合DNA吗？富集信号越高，是不是代表结合越强？

ChIP是研究蛋白与DNA相互作用常用的实验方法，主要用于验证目标蛋白在特定DNA区域的富集情况，也可以结合ChIP-seq筛选潜在的DNA结合区域。

但很多同学真正做实验时，经常会遇到染色质打断不理想、IgG背景高、目标DNA富集不明显、结果不会分析等问题。

辉骏生物从ChIP实验原理、实验步骤、结果解读，到ChIP-qPCR和ChIP-seq文献案例，带大家把ChIP一次讲清楚。

ChIP实验原理

ChIP（染色质免疫沉淀）主要利用特异性抗体，富集与目标蛋白相关联的DNA片段。

简单来说，先利用甲醛固定细胞内的蛋白-DNA复合物，再通过超声将染色质打断。随后加入目标蛋白抗体和Protein A/G磁珠，将目标蛋白及其相关DNA片段一起沉淀下来。

最后经过洗涤、解交联和DNA纯化，获得的DNA可用于：

ChIP-qPCR：验证目标蛋白是否富集在已知DNA区域。

ChIP-seq：筛选目标蛋白在全基因组范围内的富集区域。

图1 ChIP实验原理图

ChIP实验详细步骤

1、正式实验前，需要提前准备好：

图2 ChIP实验前准备

注意：样本状态、ChIP抗体的特异性和Protein A/G磁珠（辉骏货号：FI8302）的富集效果非常重要。样本处理不当、抗体特异性差或磁珠结合效率低，都可能影响后续的ChIP实验结果。

2、实验详细步骤

注意：交联条件、染色质打断、抗体选择和洗涤条件是比较关键的几个环节。

洗涤太弱，容易出现杂带和非特异结合；洗涤太强，又可能把真正的弱互作DNA一起洗掉。

因此，需要根据目标蛋白的性质对实验条件进行调整。

ChIP实验结果怎么看？

做完实验后，重点看两个部分：诱饵蛋白WB和ChIP-qPCR。

诱饵蛋白WB

通过WB检测目标蛋白是否成功免疫沉淀。

主要看：

Input组：目标蛋白是否存在；

IgG组：是否存在非特异性富集；

Anti-Bait组：目标蛋白是否成功富集。

如果Anti-Bait组有明显条带，而IgG组没有明显条带，说明IP成功。

图3 ChIP实验诱饵蛋白WB结果图

ChIP-qPCR

通过qPCR检测目标蛋白在指定DNA区域的富集情况。

主要看：

Input组：作为起始DNA含量参照；

IgG组：判断非特异性富集背景；

Anti-A组：检测目标DNA区域的富集程度。

如果Anti-A组的目标DNA富集明显高于IgG组，说明目标蛋白A与B基因存在互作。

图4 ChIP-qPCR统计图

注意：ChIP-qPCR有富集，不代表蛋白与DNA直接结合，还需结合DNA pull-down实验进一步验证。

• ChIP-qPCR富集越高，说明蛋白与DNA结合越强吗？

不能直接这么判断。

ChIP-qPCR富集程度除了受到蛋白与DNA相互作用的影响，还会受到抗体特异性、交联效率、染色质打断效果、免疫沉淀效率及引物扩增效率等因素影响。

• 如果想比较药物处理前后的富集变化，应该怎么做？

可以进行ChIP-qPCR定量分析：

① 设置分组：处理组和对照组。

② 做好对照：设置Input和IgG对照，使用相同的目标蛋白抗体和引物。

③ 定量比较：采用%Input进行归一化比较，至少进行3次独立生物学重复。

ChIP文献案例解读

1、ChIP-qPCR验证CBX8与GPX4互作

CBX8在GPX4启动子区域显著富集，表明CBX8可能参与GPX4的转录调控（图5f-g）。

图5 ChIP-qPCR验证CBX8与GPX4启动子存在互作

2、ChIP-qPCR验证lnc-GD2H调控NACA与Myog互作

过表达lnc-GD2H显著降低NACA在Myog启动子区域的富集，表明lnc-GD2H可抑制NACA结合Myog启动子（图6F，由辉骏生物提供ChIP试剂盒）。

图6 ChIP-qPCR验证lnc-GD2H调控NACA与Myog互作

有需要ChIP试剂盒的小伙伴可联系辉骏生物！

3、ChIP-seq筛选MYC转录因子潜在靶基因

ChIP-seq发现MYC在POLD1启动子区域存在明显富集信号（图7a）。

RT-qPCR实验表明敲低MYC后，POLD1表达明显下降（图7b）。

JASPAR结合位点预测和双荧光素酶实验进一步分析MYC对POLD1启动子活性的调控（图7c–e）。

ChIP-qPCR证实敲低POLD1后，MYC在多个靶基因启动子区域的富集降低（图7f）。

图7 ChIP-seq筛选转录因子MYC的结合启动子

总结

做好 ChIP，富集只是第一步。对照设计、染色质打断、抗体选择、结果分析，每一步都影响最终结论。 

辉骏生物再次提醒大家：ChIP 出现 DNA 富集，不等于蛋白直接结合 DNA，也不能单独用来证明转录调控功能。 一套完整的机制研究，通常需要双荧光素酶、DNA pull-down、位点突变、功能实验相互佐证。 

有蛋白核酸互作相关实验（ChIP-qPCR、ChIP-seq、双荧光素酶、DNA pull-down）或者试剂盒需求的科研伙伴，欢迎和辉骏生物沟通。

辉骏生物简介