发表期刊：Oncogene

影响因子：7.971

合作单位：中山大学肿瘤中心

运用技术：LC-MS/MS蛋白质谱鉴定（由辉骏生物提供技术支持）

● 研究背景

鼻咽癌（NPC）是一种起源于鼻咽腔粘膜的上皮恶性肿瘤，超过70％的NPC病例被诊断为晚期疾病，局部复发和远处转移是NPC死亡的两个主要原因。越来越多的研究表明，长的非编码RNA（lncRNA）在癌症的发生和发展中起着至关重要的作用。然而，lncRNA在鼻咽癌（NPC）中的功能和调控机制仍然未知。

● 内容概述

2020年7月，中山大学肿瘤防治中心在期刊MS-Oncogene（IF₂₀₂₀=9.867）上发表题为“AR-induced long non-coding RNA LINC01503 facilitates proliferation and metastasis via the SFPQ-FOSL1 axis in nasopharyngeal carcinoma”的文章，发现LINC01503在NPC中高表达并与不良预后有关，在体外促进NPC细胞的增殖，迁移和侵袭，在体内促进肿瘤的生长和转移。LINC01503募集了富含脯氨酸和谷氨酰的剪接因子胺（SFPQ）来激活Fos like 1（FOSL1）转录，而FOSL1的过表达逆转了LINC01503敲低对NPC进展的抑制作用。此外，雄激素受体（AR）介导的转录激活是NPC细胞中LINC01503过表达以及AR配体依赖性细胞生长、迁移和侵袭的原因。这些发现表明，AR诱导的LINC01503可以通过SFPQ-FOSL1通路促进NPC发展，或成为新的NPC预后标志物和治疗靶标。

● 主要技术

RNA pull-down、RIP、RNA-Seq、ChIP、荧光素酶报告实验、过表达/敲除实验、体内肿瘤异种移植模型构建。辉骏生物为本研究提供了蛋白检测和分析服务。

● 研究路线

● 研究结果

1. LINC01503在鼻咽癌中高表达，与预后不良相关

在先前的全基因组lncRNA图谱中发现，LINC01503在鼻咽癌组织中高表达(图1A)。为了证实这一结果，研究者用定量RT-PCR方法检测了20例鼻咽癌组织和16例正常鼻咽组织中LINC01503的表达水平。结果表明，LINC01503在鼻咽癌组织中明显过表达(图1B)；此外，与正常鼻咽上皮细胞NP69和N2Tert相比，LINC01503在11个鼻咽癌细胞系中表达显著上调(图1C)。后续临床分析结果表明，LINC01503水平高的患者总体、无病和无远处转移的生存率比LINC01503水平低的患者差(图1D-F)。研究者结合LINC01503的表达和TNM分期数据，构建了一个预测鼻咽癌(214例)预后的模型，将鼻咽癌患者分为三组，Kaplan-Meier曲线显示这三组鼻咽癌患者的生存前景不同(图1G-I)。综上所述，这些发现表明LINC01503在鼻咽癌中高表达，可作为判断鼻咽癌预后的生物标志物。

  图1

2. LINC01503促进鼻咽癌细胞体外生长、迁移和侵袭                         

为了确定LINC01503在鼻咽癌中的潜在作用，研究者在HK1细胞中特异性地下调了内源性LINC01503的表达，然后进行RNA-seq以确定LINC01503被敲除后所影响的下游基因。针对这些基因的生物信息学分析结果表明，LINC01503与鼻咽癌的进展密切相关（图2A）。为了验证这些发现，研究者使用两种不同的shLINC01503质粒瞬时下调了LINC01503在HK1和SUNE1细胞中的表达，并进行了体外功能分析(图2B)。结果进一步表明，LINC01503基因的敲除显著抑制了鼻咽癌细胞的生长、增殖迁移与侵袭能力(图2C-F)。

图2

3. LINC01503与SFPQ直接结合

已有报道表明，LncRNA通过与特定蛋白相互作用而发挥功能。研究者使用生物素标记的LINC01503正义或反义序列进行RNApull down实验，然后进行质谱分析鉴定与LINC01503相互作用的蛋白(图3B)。结果表明，剪接因子SFPQ是高度富集的蛋白之一(图3C)。为进一步验证LINC01503与SFPQ之间的相互作用，研究者用抗SFPQ抗体进行了RIP实验，发现LINC01503 RNA明显富集(图3D)，敲除LINC01503后LINC01503与SFPQ之间的相互作用消失(图3E)。接下来，为确定LINC01503与SFPQ结合所需的特异性片段，研究者构建了一系列LINC01503截短质粒并进行了RNA pull down实验，发现LINC01503的敲除或过表达既不影响SFPQ mRNA水平，也不影响SFPQ蛋白水平(图3H，I)。这些结果表明，LINC01503可以直接与SFPQ结合。

图3

4. LINC01503招募SFPQ激活FOSL1转录

作为一种多功能核蛋白，SFPQ可以作为转录抑制因子或激活因子来调节基因表达。为了确定LINC01503/SFPQ在鼻咽癌中的靶基因，研究者分析了LINC01503基因敲除前后HK1细胞的RNA-seq数据。在前20个上调和下调的基因中，FOSL1在鼻咽癌组织中过表达，且与LINC01503的表达呈正相关(图4B，C)。LINC01503或SFPQ的敲除都能降低FOSL1mRNA和蛋白水平(图4D，E)。接下来，Transfac和Weblogo程序预测到在FOSL1基因的启动子区域有两个SFPQ结合位点(图4F，G)。ChIP-PCR结果表明，LINC01503基因敲除后，FOSL1启动子区域的SFPQ富集现象可被显著消除(图4H)。此外，荧光素酶报告分析表明，过表达SFPQ显著提高了FOSL1野生型启动子结构的荧光素酶活性，但不能增加突变报告结构的荧光素酶活性(图4I)。最后，DNase I酶切分析表明，LINC01503或SFPQ基因敲除显著抑制了FOSL1启动子位点的染色质可及性(图4J)。这些结果表明，LINC01503可以招募SFPQ激活FOSL1转录活性并增加其表达。

图4

5. FOSL1负责LINC01503/SFPQ介导的鼻咽癌进展

为了确定LINC01503/SFPQ是否通过激活FOSL1促进鼻咽癌的进展，研究者在HK1和SUNE1细胞中引入FOSL1过表达或空载体，稳定下调LINC01503(Sh1503)或其对照(ShCtrl)，CCK-8和集落形成实验表明，过表达FOSL1可以解除LINC01503基因敲除对细胞生长和增殖的抑制作用(图5A-C)。Transwell分析表明，LINC01503的过表达逆转了LINC010503基因敲除对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用(图5D)。这些结果表明，LINC01503通过激活FOSL1促进鼻咽癌的进展。

图5

6. LINC01503敲除对鼻咽癌肿瘤生长和转移的抑制作用

为确定LINC01503在鼻咽癌生长和转移中的作用，研究者建立了肿瘤生长模型。结果表明，LINC01503基因的敲除显著延缓了肿瘤的生长，并在大小上明显小于对照组（图6A-C）。接下来，研究者建立了腹股沟淋巴结转移模型(图6D)，结果显示LINC01503基因敲除组腹股沟淋巴结较小，重量较轻(图6E，F)；肿瘤侵袭性较弱，对皮肤和肌肉的侵袭能力减弱(图6G)；腹股沟淋巴结转移率明显低于对照组(图6H，I)。还建立了肺转移定植模型，结果表明LINC01503基因敲除组肺表面转移结节较对照组少(图6J，K)，转移结节较对照组明显减少和缩小(图6L)。这些数据均表明，LINC01503在体内促进了鼻咽癌肿瘤的生长和肺转移。

图6

7. AR激活LINC01503转录以增加其在鼻咽癌中的表达

使用Jaspar软件对LINC01503的启动子进行分析，预测了两个转录因子：ALX Homeobox 3(ALX3)和AR(图7A)。研究者发现AR的敲除明显降低了LINC01503在HK1和SUNE1细胞中的表达，ALX3的敲除则没有(图7B)。此外，AR的过表达增加了LINC01503的RNA表达(图7C)。更重要的是，AR在鼻咽癌中表达上调，并与LINC01503的表达呈正相关(图7D，E)。研究者用Jaspar软件预测了LINC01503启动子区域的两个高亲和力结合位点(图7F)，CHIP-PCR显示AR的异位表达显著增强了其在LINC01503启动子区域的富集(图7G)。荧光素酶报告实验结果表明，AR的敲除显著降低了野生型LINC01503启动子结构的荧光素酶活性，但没有降低突变报告结构的荧光素酶活性(图7H)。最后，通过DNase I酶切实验，研究者观察到AR基因敲除显著抑制了LINC01503启动子位点的染色质可及性(图7I)。这些结果说明AR激活了鼻咽癌LINC01503的转录。

图7

8. AR拮抗剂ENZ可能通过阻断LINC01503的上游转录来抑制鼻咽癌的恶性进展

为了进一步阐明LINC01503的AR配体依赖性激活，研究者进行了AR反应和抑制试验。结果表明，在AR激动剂双氢睾酮(DHT)处理过程中，LINC01503呈时间依赖和剂量依赖的激活；在拮抗剂苯扎鲁胺(ENZ)存在下，LINC01503呈时间依赖和剂量依赖的抑制(图8A，B)。有趣的是，DHT处理导致细胞功能的激活，而AR处理则导致细胞功能的抑制(图8C-E)，接下来，研究者研究了LINC01503的表达对ENZ抑制的鼻咽癌细胞恶性表型的影响，发现ENZ抑制的细胞生长、迁移和侵袭可以通过增加LINC01503在细胞中的表达来逆转(图8F-H)。这些结果证实了AR拮抗剂ENZ可能通过阻断LINC01503的上游转录来抑制鼻咽癌的恶性进展。

图8

● 结论

本研究发现LINC01503在鼻咽癌中高表达，与不良预后和较低的生存率有关。AR激活了鼻咽癌中LINC01503的转录，使LINC01503募集SFPQ到FOSL1启动子，增加FOSL1转录，促进鼻咽癌的发展。抑制LINC01503的表达和开发AR配体拮抗剂可能成为NPC的一种靶向治疗策略。