转录因子结合启动子DNA、调控基因表达是最核心、最常见的研究方向，也是SCI论文的经典创新切入点。那么如何研究转录因子与启动子的相互作用关系？

目前常用的研究思路是：ChIP-seq筛选靶基因 → JASPAR预测结合位点 → ChIP-qPCR、DNA pull-down WB验证结合 → 双荧光素酶验证调控 → 启动子截短/位点突变锁定关键区域和位点 → 功能实验验证。

辉骏生物从靶基因怎么筛、结合怎么验证、关键区域和位点怎么找，以及Nature Communications文献应用案例几个方面，讲清楚转录因子与启动子互作的完整研究思路。

前期筛选：找到靶基因和潜在结合位点

如果已知转录因子，但不知道它调控哪些下游基因，可以通过ChIP-seq分析其在全基因组范围内的DNA结合区域，并筛选潜在靶基因。

注意：如果研究对象是植物、微生物等，没有合适的IP抗体，也可以做DAP-seq来体外筛选转录因子的结合位点。

图1 ChIP-seq筛选转录因子EGR1潜在靶基因

如果已知启动子DNA，可通过JASPAR、motif等数据库预测潜在转录因子结合位点。

图2 JASPAR数据库预测转录因子STAT1结合位点

简单来说，ChIP-seq解决“可能调控哪些基因”；JASPAR解决“可能结合启动子的哪个位置”。

验证转录因子是否调控靶基因表达

筛选到候选靶基因后，可以敲低或过表达转录因子，检测靶基因表达是否发生变化。

✅qPCR：检测靶基因mRNA水平。例如转录因子敲低后，靶基因mRNA显著下降，说明转录因子可能正向调控靶基因转录。

✅WB：进一步检测靶蛋白表达水平是否发生相应变化。

图3 qPCR和WB检测敲低转录因子YY1后TRIM34的表达

注意：qPCR和WB只能说明存在表达调控，还不能证明转录因子直接结合启动子。

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验证转录因子与启动子的结合

1、ChIP-qPCR：验证细胞内结合

根据JASPAR预测的BS1、BS2、BS3等潜在结合区域设计ChIP-qPCR引物。

ChIP实验首先将蛋白与DNA交联，再利用目标转录因子抗体进行免疫沉淀，最后通过qPCR检测目标启动子区域是否被富集。

图4 ChIP-qPCR技术路线图

2、双荧光素酶报告基因：验证转录调控

将目标基因启动子克隆到荧光素酶报告载体中，再与转录因子过表达或干扰载体共同转染。

如果转录因子过表达后，启动子荧光素酶活性升高，说明该转录因子能够促进启动子转录；如果活性下降，则可能发挥转录抑制作用。

图5 双荧光素酶报告基因技术路线图

注意：ChIP-qPCR回答的是“有没有结合”；双荧光素酶回答“有没有调控启动子活性”。

3、DNA pull-down WB：进一步体外验证直接结合

如果还想进一步验证转录因子与目标DNA区域在体外是否能够结合，可以进行DNA pull-down WB。

实验利用生物素标记的DNA探针捕获结合蛋白，再通过WB检测目标转录因子。

图6 DNA pull-down WB技术路线图

  小 结  

以上3种技术是目前文章中比较常用的转录因子与靶基因启动子互作验证的技术手段（辉骏生物均可提供服务）。

一般来说文章会选择2种及以上技术手段进行验证，同时考虑兼顾体内验证和体外验证，有需要可以联系辉骏生物：4006991663！

进一步定位关键调控区域和结合位点

1、启动子截短：找关键区域

如果启动子区域较长，可以构建不同长度的启动子截短片段，例如−2000bp、−1500bp、−1000bp、−500bp和−450bp，分别进行双荧光素酶实验。通过比较不同截短片段在转录因子作用下的启动子活性变化，可逐步定位关键调控区域。

注意：所有截短体都必须包含转录起始位点（0）

将启动子从−500bp截短至−450bp后，STAT1的促进作用消失，说明关键调控区域可能位于TSS上游−500～−450bp。

图7 启动子截短双荧光素酶实验

2、位点突变：找关键结合位点

确定关键区域后，可以进一步对其中预测的BS1、BS2、BS3等结合位点分别进行突变，再进行双荧光素酶实验。

如果BS2突变后，转录因子对启动子的促进或抑制作用明显减弱甚至消失，说明BS2可能是该转录因子发挥调控作用的关键结合位点。

Nature Communications文献案例

下面来看一个完整的转录因子与启动子互作研究案例。

IPA分析：预测EGR1可能是Areg的上游转录因子（图8a）。

qPCR：敲低EGR1后，Areg mRNA明显下降，说明EGR1参与Areg转录调控（图8b）。

JASPAR预测：Areg启动子区域存在3个潜在EGR1结合位点S1–S3（图8c、8d）。

ChIP-qPCR：证实转录因子EGR1与Areg启动子存在互作（图8e、8f）。

位点突变+双荧光素酶：突变S1和S3后，EGR1介导的Areg启动子活性明显降低，提示S1和S3是EGR1调控Areg的重要结合位点（图8g、8h）。

这个案例基本就是一条典型路线：预测上游转录因子 → 验证表达调控 → 预测结合位点 → ChIP验证结合 → 位点突变+双荧光素酶锁定关键位点。

图8 转录因子EGR1与Areg启动子互作验证

研究转录因子与启动子的相互作用，可以简单记住“筛选 → 表达 → 结合 → 调控 → 位点 → 功能”，逐步验证，就能够构建一条较完整的转录因子—启动子—靶基因调控机制。

如有ChIP-seq、ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因实验、DNA pull-down MS/WB实验相关技术疑问或试剂订购需求，欢迎随时辉骏生物~