Co‑IP 是体内蛋白互作验证的经典手段，分为内源 Co‑IP 与标签 Co‑IP。辉骏生物结合大量项目实操经验发现诸多科研人员面临以下相同困境：

①标签 Co‑IP 结果缺少内源验证，遭遇审稿人质疑 

②内源 Co‑IP 易受抗体、蛋白丰度干扰，实验稳定性不足 

③两种体系数据相悖，难以支撑论文结论 

两类实验体系各有特点，适用场景各不相同。辉骏生物从五大维度系统对比内源 Co‑IP 与标签 Co‑IP，帮助研究者合理开展实验设计，规避科研路上常见难题。

1 内源Co-IP与外源CO-IP实验原理

Co-IP：免疫共沉淀，顾名思义，就是利用抗体对抗原的特异性"免疫结合"，调取样本中的目标抗原（即目标蛋白）及其结合蛋白。

这个技术捕获的是样本中已经存在的蛋白复合体，所以我们要注意：

（1）要用温和的裂解液（IP裂解液）裂解样本，以保证细胞内的蛋白复合体不会因操作而被打散；

（2）要用IP级别的抗体来调取目标抗原。

根据目标蛋白的不同来源，又可以分为：

• 内源Co-IP：

用特异性高、亲和力好的诱饵蛋白IP级别抗体（实验成败的关键），来捕获细胞内天然表达的靶蛋白及其生理状态下的互作蛋白。

它能最大程度保留蛋白互作的生理状态，更贴合体内真实互作场景，互作蛋白可信度高。

图1 辉骏生物内源Co-IP原理图

• 外源Co-IP（通常为标签Co-IP）：

当内源蛋白表达量较低时，可以通过质粒转染来过表达诱饵蛋白，降低IP难度。

如果我们在过表达时让蛋白带上某个“标签”（例如Flag、HA、V5等），还能采用相应的标签抗体磁珠来IP，这些抗体磁珠便宜又好用，同步解决了“IP级别抗体太贵或不好用”的问题，也省去了抗体与磁珠孵育的步骤。

但过表达的蛋白含量偏高于生理状态，可能会存在假阳性互作，或更多的非特异性结合。

图2 辉骏生物标签Co-IP原理图

简单来说，内源CoIP依托天然内源蛋白+特异性靶蛋白抗体，捕获更天然状态下的蛋白互作；标签CoIP依托标签融合蛋白过表达+标签抗体磁珠，更高效富集互作蛋白。具体区别如下：

2  内源Co-IP与外源CO-IP主要应用场景

• 内源Co-IP

内源性Co-IP一般用于验证性或者是发现性的研究。在天然环境下，筛选和发现内源性靶蛋白结合的已知/未知蛋白。

图3 GSNOR蛋白的IP-MS鉴定示意图-辉骏生物

• 标签Co-IP

与内源CoIP一样，外源性CoIP也可以筛选和发现已知/未知结合蛋白，此外，还可以通过构建截短体、点突变等，找到蛋白互作的结构域。

图4 MYC蛋白截短体构建示意图-辉骏生物

3 内源Co-IP与外源CO-IP实验核心步骤

• 内源Co-IP

图5 内源Co-IP核心步骤-辉骏生物

• 标签Co-IP

图6 标签Co-IP核心步骤-辉骏生物

辉骏生物IP专用二抗、Flag/HA/V5/GFP/RFP这5款类型的标签纳米抗体磁珠，有效避免抗体轻重链污染，结合量高，亲和力强。

4 内源Co-IP VS 外源CO-IP周期和成本

• 内源Co-IP

不需要构建质粒和转染，理论上总周期更短，但CoIP结果的好坏与IP抗体质量和内源蛋白的表达量息息相关，实验难度和不可控因素较多，实际的周期可能会更长。

需要购买诱饵蛋白的IP级别抗体，价格更高。

• 标签Co-IP

构建载体和转染会让总周期增加，要提前评估实验难度，否则后续Co-IP可能无法开展。如果前期实验顺利，CoIP难度更低，总周期更可控。

标签抗体磁珠的亲和力好，价格低廉。

5 内源Co-IP与外源CO-IP结果解读

• 内源Co-IP

Input：初始细胞裂解液，用来评估蛋白的表达情况和抗体效果，也可以作为WB实验的阳性对照。

IP对照组：用正常IgG做IP，由于IgG本身不结合任何蛋白，如果有条带，说明存在非特异性结合，结果不可信。

IP实验组：用CXCR3抗体（目标诱饵蛋白抗体）做IP，再分别用CXCR3抗体和Beclin1抗体（待测蛋白）做WB检测。CXCR3抗体检测有条带，说明IP成功；Beclin1抗体检测有条带，说明CXCR3与Beclin1有相互作用。

图7 内源Co-IP结果解读-辉骏生物

• 标签Co-IP

Input：与内源Co-IP Input作用是一样的，这里可以看质粒是否转染成功。转染某个质粒后显示有条带，说明蛋白表达成功。

IP对照组：共转HA空载体质粒+Flag-MVP质粒。

IP实验组：共转HA-ASK1质粒+Flag-MVP质粒，用HA抗体进行IP，再分别用HA抗体和Flag抗体（待测蛋白）做WB检测。HA抗体检测有条带，说明IP成功；Flag抗体检测有条带，说明HA-ASK1与Flag-MVP存在相互作用。

图8 标签Co-IP结果解读-辉骏生物

辉骏生物总结：内源性Co-IP & 外源性Co-IP在哪种情况下适用：

✅如果想要验证两个蛋白的相互作用，两种方法均可，很多文章会同时使用两种方法验证。如果条件不允许而只能选其一，在易于构建载体和转染的基础上，优选外源Co-IP，操作简单，成功率高。

✅如果想要寻找未知蛋白的互作蛋白，两种方法均可，可以根据实验难度、抗体效果、周期和成本等综合考虑。

✅如果想要证明互作在某种疾病或者生理状态下发生，需要用特定组织样本做，则选内源Co-IP。

✅如果想要研究互作的具体区域或关键位点，用外源Co-IP，方便构建各种突变体或截短体。

值得注意：内源 Co‑IP 与标签 Co‑IP 仅能够证实胞内蛋白存在相互作用，无法区分直接结合与间接结合。若需验证蛋白直接互作，可采用 GST pull down 开展体外结合实验。

需获取 Co-IP 完整 protocol、蛋白互作外包实验需求，可咨询辉骏生物：4006991663，一站式解决内源 CoIP、标签 CoIP、Pull down 等实验需求。