现阶段验证 RNA 与蛋白结合的主流实验有 RIP、RNA pull down、CLIP、FISH-IF 共定位，RIP 和 RNA pull down 应用最为广泛。辉骏生物将详细介绍这两项经典互作实验技术。

注意：

* RIP和RNA pull-down这二者是最基础的RNA-蛋白互作验证；

* CLIP是RIP的升级版，可获得精确结合位点，机制文章标配；

* FISH-IF不直接证明结合，但提供细胞空间层面的直观证据，常作为辅助佐证实验；

* 区分GST pull-down，该实验多用于蛋白-蛋白体外互作，极少用于RNA-蛋白体系。

如何证明RNA与蛋白分子互作的完整实验思路？

第一步，筛选候选互作分子，锁定互作靶点

通过RIP-seq或者生物信息学预测等方法，筛选目标蛋白结合的候选RNA，初步锁定潜在互作分子。

图1 RIP-seq筛选目标蛋白的结合RNA

或通过RNA pull down MS筛选出与目标RNA结合的候选蛋白，初步锁定潜在互作分子。

图2 RNA pull-down MS筛选目标RNA的结合蛋白

第二步，证明两个分子之间存在特异性结合

RIP实验是通过特异性抗体富集细胞内天然状态下的RNA-蛋白复合物，富集RNA并qPCR定量，可以证明RNA和蛋白在细胞体内存在内源性结合，但无法区分是直接结合还是间接结合。

图3 RIP实验技术流程图

RNA pull-down是利用生物素标记RNA探针调取结合蛋白，可以证明RNA与蛋白在体外体系发生直接结合。

图4 RNA pull-down技术流程图

注意：体内RIP与体外RNA pull down相互佐证，两套实验体系同时具备，结合结果一致，互作结论才可靠、完整。

第三步，证明二者的具体结合位点

可以通过构建RNA截短突变体、RNA定点序列突变体、蛋白结构域截短突变体，结合RNA pull down、RIP回补实验验证核心结合区域；也可通过RNA二级结构筛选、特异性序列肽库筛选等方法确定特异性结合位点。

图5 ACIL不同RNA截短突变体的示意图

注意：需要同步分析RNA与蛋白结合后，对RNA稳定性、核质定位、翻译水平以及蛋白表达、修饰、定位、降解产生的具体影响。

第四步，功能验证

功能验证较为复杂，要基于具体的实验进行设计，包括正反验证、分子本身表达验证、下游信号通路验证，也涉及敲低/过表达靶RNA或靶蛋白后，观察细胞功能变化以及动物疾病表型的改变，明确互作的生物学功能。

• 过表达/敲低目标RNA/蛋白，检测互作强弱变化；

• 验证下游靶基因、信号通路表达改变；

• 细胞表型（增殖、迁移、侵袭、凋亡）功能实验；

• 动物水平表型验证（高分文章加分项）。

到这里整个逻辑差不多就完整啦，辉骏生物带大家来看看具体的案例解析：

RNA-蛋白互作研究范式：《The EGR1-mediated lncRNA TENM3-AS1 potentiates gastric cancer metastasis via reprogramming fatty acid metabolism》以这篇文献为例。

第一步：筛选找到lnRNA TENM3-AS1的潜在结合蛋白

这是采用生物素标记TENM3-AS1探针开展RNA pull-down富集结合蛋白后（图C），再通过质谱（MS）鉴定得到的蛋白清单（图D，由辉骏生物提供质谱技术）。

评判依据为蛋白富集度与结合特异性，富集程度越高，代表该蛋白与TENM3-AS1结合越稳定，越可能是真实互作蛋白。可以看到，hnRNPK的富集水平是所有候选蛋白中最高的，说明它和TENM3-AS1的结合信号最强，因此被选为核心研究对象。

第二步：RNA pull-down的Western Blot体外验证

这是质谱筛选结果的初步WB验证：采用生物素标记TENM3-AS1开展RNA pulldown富集蛋白，阴性对照用于排除非特异性结合。WB结果显示，TENM3-AS1沉淀复合物中可检出hnRNPK特异性条带，阴性对照组无条带，进一步证实hnRNPK为TENM3-AS1的特异性互作蛋白（图E）。

第三步：RIP-qPCR——体内验证佐证二者的结合

为了进一步证实二者在细胞内源环境下的结合，排除抗体非特异性结合干扰，研究人员在HGC27、BGC823细胞中进行RIP qPCR互作验证。

图F：IP-hnRNPK，qPCR检测TENM3-AS1，IgG 为阴性对照

利用hnRNPK抗体富集细胞内蛋白-RNA复合物，IgG作为阴性对照，通过 qPCR定量检测沉淀复合物中TENM3-AS1的富集水平。结果显示，仅hnRNPK抗体沉淀组可显著富集TENM3-AS1，证明二者在内源细胞生理体系中能够稳定结合，与体外pulldown实验结果相互印证。

第四步： 找到TENM3-AS1与hnRNPK互作的关键结构域（RNA层面）

为了验证预测的结合片段，研究人员构建了多段TENM3-AS1分段探针：5'端外显子片段、其余分段RNA片段。

图G：TENM3-AS1截短体构建示意图、分段探针RNA pull-down验证

分别采用不同TENM3-AS1分段生物素探针富集细胞蛋白，WB检测hnRNPK表达水平。

结果明确：只有TENM3-AS1 5' 端外显子片段可有效捕获hnRNPK；其余分段 RNA片段均无明显结合信号。

由此确定：TENM3-AS1的5' 端外显子片段，是与hnRNPK互作的核心RNA区域。

第五步：找到hnRNPK与TENM3-AS1互作的关键结构域（蛋白层面）

为了验证预测的结合区域，研究人员构建了多种 hnRNPK 截短突变体，均携带 Flag标签，用于结构域互作验证：含KI结构域截短体、缺失KI结构域截短体

图H：hnRNPK截短体示意图、截短体RIP验证

将各Flag-hnRNPK截短体分别转染细胞，用Flag抗体做RIP，qPCR检测 TENM3-AS1。

结果明确：只有携带KI结构域的hnRNPK截短体，能结合TENM3-AS1；缺失 KI结构域的截短体，完全无法与TENM3-AS1结合。

由此确定：hnRNPK的KI结构域，是与TENM3-AS1互作的关键区域。

辉骏生物RNA免疫共沉淀（RIP）实验服务内容

1. RIP qPCR（验证型）服务内容：

Input 样本诱饵蛋白 WB 质控检测；设置实验组、对照组，富集诱饵蛋白及其结合 RNA；靶标 RNA qPCR 定量检测

交付结果：完整 RIP 实验报告、蛋白 WB 原图、qPCR 检测原始数据

2.  RIP seq（筛选型）服务内容：

Input 样本诱饵蛋白 WB 质控检测；实验组、对照组富集结合 RNA；高通量测序 + 生物信息分析（实验组、Input 对照）

交付结果：完整 RIP 实验报告、蛋白 WB 原图、测序原始数据、全套生信分析报告