不少科研人员开展转录调控课题时困惑：如何有效验证转录因子与启动子 DNA 相结合？这组互作证据是完善分子机制、冲刺高分 SCI 不可或缺的一环。辉骏生物汇总主流实验技术，为大家系统讲解体内、体外验证方案。

01 ChIP-qPCR（优选，体内实验）

ChIP-qPCR是一种用于研究体内蛋白质和DNA相互作用的重要技术。将ChIP（染色质免疫沉淀）实验与qPCR（实时荧光定量PCR）检测相结合，可以精准定量特定蛋白质与目标基因位点的结合水平。ChIP技术利用抗体特异性富集结合特定转录因子（TF）/组蛋白修饰结合的DNA片段；qPCR技术以SYBR荧光染料为检测基础，染料可非特异性嵌入DNA双链结构，并产生荧光信号，使荧光信号强度与PCR产物扩增量完全同步，最终通过Ct值（循环阈值）完成定量检测，可以计算出结合蛋白的富集水平。

ChIP-qPCR能够专一，灵敏，快速，高重复地定量生物样品中特定转录因子/组蛋白修饰与已知基因启动子的结合。ChIP-qPCR因其体内富集（相比体外实验）能够更真实地反映结合状态的特性，被众多老师青睐，也是文章首选验证方式。

• 实验流程：

图1 ChIP实验流程示意图-辉骏生物ChIP实验服务

02 双荧光素酶报告基因（体内实验）

双萤光素酶报告基因（Dual-Luciferase）检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。以Luciferase为核心，构建待测启动子报告质粒与携带海肾荧光素酶基因的内参质粒，转染细胞，裂解细胞，分别加荧光素酶底物，用荧光测定仪检测荧光强度，通过数据得出基因表达量，从而确定构建序列的功能（正调控或负调控）。

双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。该技术通常需要与其他技术配合验证。

• 实验流程：

图2 双荧光素酶报告基因实验流程示意图-辉骏生物

03 DNA pull-down WB（体外实验）

DNA pull-down WB是一种用于研究体外DNA和蛋白质相互作用的重要技术。将DNA pull-down（DNA下拉富集）实验与WB（蛋白质免疫印迹）检测相结合，可以精准验证特定DNA序列与特定靶蛋白的结合。DNA pull-down技术利用生物素标记探针，特异性富集与目标DNA结合的蛋白片段；WB技术以抗原抗体特异性结合为检测基础，特异性识别靶蛋白，激发显色发光信号，保证信号强度的变化与样品中靶蛋白含量的变化完全同步，最后利用条带灰度值进行定性半定量分析，可以检测出目标DNA与靶蛋白的结合水平。

DNA pull-down WB能够专一、灵敏、直观、稳定地验证样本中目标DNA与下游结合蛋白的体外互作关系。DNA pulldown WB因其体外靶向筛选（相比体内实验）能够明确DNA与蛋白直接结合关系的特性，被广泛应用于分子互作机制研究，也是文章验证体外互作的经典方式。

• 实验流程：

图3 DNA pull-down实验流程示意图-辉骏生物

以上3种技术是目前文章中比较常用的转录因子与靶基因启动子互作验证的技术手段（辉骏生物可提供ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因、DNA pull-down WB实验服务），一般来说文章会选择2种及以上技术手段进行验证，同时考虑兼顾体内验证和体外验证，在实际应用中，可以根据实验目的和样品特点选择合适的方法。

客户研究案例一：

• 发表日期：2025年5月

• 发表期刊：Advanced science

• 影响因子：14.1

• 实验方法：ChIP-seq、ChIP-qPCR、JASPAR数据库、双荧光素酶报告基因实验等

• 结果解读：验证转录因子STAT1与MAP3K8启动子互作

图4 转录因子STAT1与MAP3K8启动子互作验证示意图

客户研究案例二：

• 发表日期：2025年6月

• 发表期刊：Molecular cancer

• 影响因子：33.9

• 实验方法：ChIP seq、motif分析、ChIP qPCR、JASPAR数据库、双荧光素酶报告基因实验等

• 结果解读：验证转录因子EGR1与启动子TENM3-AS1互作

图5 转录因子EGR1与启动子TENM3-AS1互作验证示意图

客户研究案例三：

• 发表日期：2018年9月

• 发表期刊：Journal of hematology & oncology

• 影响因子：40.4

• 实验方法：DNA pulldown MS、DNA pulldown WB、ChIP qPCR等

• 结果解读：验证XRCC5蛋白与CLC-3启动子的相互作用

图6 XRCC5蛋白与CLC-3启动子互作验证示意图

辉骏生物把研究启动子与转录因子结合的实验设计中常用的几种方法汇总如下：

参考文献

[1] Lan W, Chen X, Yu H, et al. UGDH Lactylation Aggravates Osteoarthritis by Suppressing Glycosaminoglycan Synthesis and Orchestrating Nucleocytoplasmic Transport to Activate MAPK Signaling. Adv Sci (Weinh).

[2] Tang Y, Zhao B, Wang W, et al. The EGR1-mediated lncRNA TENM3-AS1 potentiates gastric cancer metastasis via reprogramming fatty acid metabolism. Mol Cancer 24(1):165(2025).

[3] Gu Z, Li Y, Yang X, et al. Overexpression of CLC-3 is regulated by XRCC5 and is a poor prognostic biomarker for gastric cancer. J Hematol Oncol 11(1):115(2018).

DNA pull down * 服务信息

染色质免疫共沉淀chip实验服务信息

双荧光素酶报告基因实验 * 服务信息