免疫共沉淀（Co-IP）是体内验证蛋白互作的经典技术，内源 Co-IP 广泛应用于细胞、肿瘤方向机制研究。实验原理简洁，借助磁珠或琼脂糖树脂偶联抗体捕获靶蛋白，富集结合的互作蛋白。

实操阶段常常遇到无条带、杂带严重等难题，另外 IP 条带深浅与互作强度关系、正反拉结果不一致如何判定，也是科研工作者常见疑问。大量盲目重复实验，造成试剂与样本浪费。

辉骏生物结合多年项目实操经验，系统梳理内源 Co-IP 完整实验方案，涵盖原理、操作规范、条带判读与实验避坑要点，助力高效开展蛋白互作验证研究。

内源Co-IP实验基本概述

1、实验原理

样本裂解后，孵育诱饵蛋白抗体，抗体捕获样本中的诱饵蛋白，再与protein A/G beads孵育，将“抗体-诱饵蛋白-互作蛋白”一起“共沉淀”到Beads上。洗掉未结合的蛋白后，再将“诱饵蛋白-互作蛋白”从Beads上洗脱下来，得到Co-IP洗脱液，该洗脱液既可用于Western Blot检测（验证已知结合蛋白），也可用于质谱鉴定（筛选未知结合蛋白）。

图1 内源蛋白Co-IP原理图

当诱饵蛋白IP抗体不好用或者内源表达量低时，可以在样本中融合表达带有特定标签的诱饵蛋白，利用标签抗体做免疫沉淀，也就是标签蛋白Co-IP。

2、主要优缺点

优点：

①无需载体构建；

②能最真实地反映生理状态下的蛋白行为；

③互作信息可信度高。

缺点：

①当目标蛋白丰度低的话，可能会IP不成功；

②对抗体特异性和亲和力的要求极高，需要IP级别的目的蛋白抗体，成本高；

③而且容易出现抗体轻重链污染，比如目标蛋白刚好在55kD和25kD，抗体条带可能掩盖目标蛋白条带，导致结果不好判断。

内源Co-IP详细操作步骤

1、总蛋白提取

1.1 动物细胞样本

（1）培养目标细胞，待细胞生长至合适密度，收集细胞；

（2）用预冷PBS缓冲液清洗细胞2-3次，加入300-500 μL预冷的IP裂解缓冲液（辉骏货号为：FI8101），在IP裂解液中预先加入3-5 μL蛋白酶抑制（辉骏货号为：FI8105），现用现配；

（3）4℃混匀仪上裂解30 min；为了更充分裂解，最好冰上超声至溶液基本澄清（如果无超声条件，可置于冰上裂解30 min，期间每10 min涡旋混匀一次，每次5 s）；

（4）4℃离心机12000 rpm离心15min，收集上清至新的1.5 mL EP管中。

注意：保证加入足量的蛋白酶抑制剂，实验需全程在冰上操作，避免蛋白出现降解。

1.2 动物组织样本

用预冷的PBS清洗新鲜组织，去除血液等成分；实验组和对照组分别取0.1-0.2 g干净的组织，用液氮在研钵中充分研磨，随后转移至预冷的新离心管中。后续步骤与处理细胞时相似（超声破碎时间可稍长，但一般不超过5min）。

2、Input 样品制备与检测

每组取30 μL蛋白，加1×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，95℃加热5-10 min；WB验证目标蛋白表达。

图2 WB检测input样本蛋白表达情况

3、总蛋白与抗体孵育

蛋白样本分两组，实验组加IP级目标蛋白抗体，对照组加同源同型Normal IgG（分组如下图所示）；每组加入相应的抗体之后，置于混匀仪4℃孵育4h或过夜。

图3 内源Co-IP实验分组设计

4、Protein A/G 磁珠与抗体结合

向磁珠中加入蛋白样本/抗体复合物，充分混匀，置于4℃混匀仪上孵育3-4 h。（注意：视频里面展示的是磁珠与抗体先孵育，再与蛋白样本进行共孵育。这两种步骤呢都是可以的~）

对于内源性IP实验，磁珠要选择结合效率高的，可以减少非特异结合，推荐辉骏生物proteinA/G磁珠（辉骏货号：FI8302），亲测IP结果超好，条带又亮又干净！

5、清洗磁珠

孵育结束后，放磁力架上静置1 min，弃上清，加入500 μL漂洗缓冲液，颠倒混匀30次；放磁力架上静置1 min，弃上清，重复上述洗涤步骤2次。

6、蛋白洗脱

6.1 变性洗脱

加50 μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液，振荡瞬离后95℃加热5-10 min；磁力架静置1 min，收集上清用于检测或切胶质谱。

6.2 非变性洗脱

向磁珠中加入40-50 µL洗脱缓冲液（辉骏货号为：FI8102），放混匀仪上室温洗脱10-15 min，随后振荡瞬离后磁力架静置1 min，收集上清用于检测或切胶质谱。

注意：非变性洗脱法可以保持蛋白的活性，变性洗脱法的洗脱效率更高，但抗体轻重链的污染也更严重。

如果只是WB时IgG的轻重链太深不好看，其实可以不管，不会影响什么。但是如果刚好在诱饵蛋白或者互作蛋白位置，影响结果判断了，有三个方法：一个是选择IP专用的二抗；一个是跟IP抗体不同种属的一抗；还有一个是在样本中过表达带标签的目标蛋白，用标签纳米抗体磁珠进行IP。

辉骏生物现有IP专用二抗、Flag/HA/V5/GFP/RFP这5款类型的标签纳米抗体磁珠，可有效避免抗体轻重链污染，有需要的小伙伴可以联系！

7、蛋白检测

✅WB用Anti-Flag和Anti-Prey检测靶蛋白互作；

✅或者LC-MS/MS鉴定SDS-PAGE胶中的未知互作蛋白。

图4 CoIP-MS技术流程

辉骏生物自有质谱检测平台，擅长IP、pull-down产物等微量蛋白的质谱鉴定及生信分析。

内源Co-IP实验注意事项

1️⃣抗体选择（重中之重）：优先选说明书明确标注「可用于IP实验」的内源性抗体，特异性更强、结果更稳； 

2️⃣磁珠选择（决定实验成败）：优先选结合效率高、非特异结合少的蛋白A/G磁珠，辉骏生物proteinA/G磁珠（货号FI8302），好用到反复回购，IP结果清晰、背景干净，省去后续很多麻烦； 

3️⃣样本处理：全程冰上操作，裂解液务必新鲜加蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂； 

4️⃣抗体-磁珠孵育：先将抗体与磁珠孵育结合，再加入样本裂解液孵育（孵育时间需要根据你目的蛋白的表达水平或者是抗亲和力来进行确定）； 

5️⃣洗涤步骤：至少洗涤3次，去除未结合的杂蛋白，减少背景干扰，但注意不要过度洗涤，避免目标蛋白流失。

内源Co-IP结果解读

Input组：利用Anti-Bait、Anti-Prey对样本裂解液进行WB检测，验证Input中是否存在Bait、Prey，从而确定蛋白的表达情况以及抗体效果；

IgG组(阴性对照组)：排除非特异性结合的干扰，normal IgG不能富集Bait，一般不会有Bait条带，如果有条带说明Bait与beads或IgG有非特异性结合，需要重新完善下方法；

IP组(实验组)：Anti-Bait可以特异性富集Bait，所以一定会有Bait条带，没有条带说明IP实验失败，需要复核IP流程，或检查Anti-Bait是否可以用于IP实验；如果IP洗脱液中也能检测到Prey，说明Bait和Prey存在相互作用。

图5 内源性蛋白Co-IP实验结果解析图

内源性Co-IP实验验证两个已知蛋白（Bait和Prey）是否存在相互作用，如果最终的结果均有条带，则可以证明两个蛋白之间存在相互关系，上图为IP阳性结果示意图：表明Bait可以与Prey结合，存在相互作用。

文献解读1：

作者通过在Hepa1-6细胞中进行免疫共沉淀实验以验证PRMT3和HSP60是否存在相互作用，正反拉Co-IP结果证实内源HSP60与PRMT3发生相互结合（图6）。

这一结果明确了内源水平下HSP60与PRMT3的蛋白结合关系，为解析二者协同调控细胞生理过程的分子机制提供了关键实验依据，为后续相关功能机制研究奠定了重要基础。

图6 Co-IP验证PRMT3与HSP60蛋白互作

文献解读2：

为确定FBXO7是否作为E3连接酶介导PRMT1的降解，作者检测了二者之间的物理相互作用。Co-IP分析进一步证实了在人Huh7和PLC/PRF/5肝癌细胞中，内源性FBXO7与PRMT1的结合（图7）。

该结果明确了FBXO7与PRMT1的蛋白结合特性，为证实FBXO7作为E3连接酶调控PRMT1蛋白降解的分子机制提供了直接的实验证据，也为后续深入阐释二者在肝癌细胞中的功能调控机制奠定了实验基础。

图7 Co-IP验证PRMT1与FBXO7蛋白互作

Co-IP常见问题解析

Q1：磁珠可以反复使用吗？

不可以，洗脱的过程可能会造成磁珠表面的抗体不可逆流失或者失活，结合效率不能保证。

Q2：protein A/G磁珠和抗体结合后，在煮样洗脱时，抗体会掉下来吗？会有抗体轻重链污染吗？

protein A/G磁珠是和抗体的Fc段非共价结合的，所以变性洗脱就会掉落产生抗体轻重链污染。

Q3：Input会不会出现轻重链？

Input是未经处理的初始样本裂解液，没有加入外源性抗体（或者抗体磁珠）孵育，所以是不会有轻重链污染的。

Q4：IP条带越深，结合越强吗?

IP条带深浅除了跟结合强弱有关，也受IP效率影响，因此不同抗体或不同批次的IP实验不能依靠条带深浅来判断结合强弱。

如果您要做定量IP实验，需要确保组别间有相同的上样量（借助内参来确定）、相同的抗体及用量，相同的实验条件，再根据IP条带的深浅来判断结合的强弱。

Q5：正拉Co-IP可以拉下条带，而反拉验证结果没有，这是什么原因呢？

Co-IP的A拉B和B拉A验证，效率和条件本身就不同。A的抗体质量好、捕获效率高，就能拉到B；B的抗体亲和力低或者表位被遮挡，反向Co-IP就可能拉不到。这种情况就需要优化抗体和裂解条件，或借助其他方法来进一步判断，而不是直接否定蛋白互作。

Q6：IgG抗体有什么注意的吗？是跟目标一抗相同来源（鼠源或者兔源）的吗？

是的，跟目标一抗相同来源。

Q7：实验组是si可以做IP吗？

有难度，本来ip就是要调诱饵蛋白，如果这个蛋白表达量又很低，很可能调取不到，一般不建议这样做。

Q8：IP结果有抗体轻重链污染怎么办？

如果是内源IP，可以选择IP专用二抗来减轻抗体污染。

如果是标签IP，可以选择标签（Flag/HA/V5/GFP/RFP）纳米抗体磁珠来完全避免抗体污染。

有以上产品需求的小伙伴可以联系辉骏生物~

Q9：input组有条带且检测效果很好，IP组无条带

（1）可能原因：抗体不适合做IP或用量不足。

✅解决方法：①优先选择标注“CoIP验证”的抗体；②增加IP抗体或样本的使用量

（2）可能原因：抗体与beads的结合效果差。

✅解决方法：①增加孵育时间；②检查磁珠质量，避免磁珠过期或干燥使磁珠失活。

（3）洗脱步骤不充分，目标蛋白未完全从beads上洗脱。

✅解决方法：①直接将beads煮沸上样（减少洗脱损失）；②如果必须用非变性洗脱法，可以延长洗脱时间至15 min。

Q10：input组无条带，IP组有条带

（1）可能原因：样本蛋白浓度低或上样量少。

✅解决方法：增加input组的蛋白上样量。

（2）可能原因：保存不当，导致样本降解。

✅解决方法：①全程冰上操作；②样本裂解液中加入足量蛋白酶抑制剂, ③避免样本反复冻融。 

（3）可能原因：IP组出现了假阳性结果。

✅解决方法：进行质谱检测或更换其他抗体确认。

Q11：Co-IP实验中目的蛋白上方出现多条条带，这是什么原因呢？

Co-IP中目的蛋白上方的出现多条条带，说明结合了多个蛋白，这可能是泛素化、磷酸化等翻译后修饰的产物，也可能是非特异性结合。要区分它们，需要用不同的检测抗体做复染，或者用质谱确认。

辉骏生物可提供专业蛋白质谱鉴定服务，快速鉴定互作蛋白、识别蛋白翻译后修饰，支撑蛋白互作相关课题研究

辉骏生物简介

广州辉骏生物科技股份有限公司（Fitgene）创立于 2011 年，拥有十余年科研服务经验。专注蛋白与分子互作相关实验服务：蛋白质谱检测、蛋白 / RNA/DNA/ 化合物互作验证、稳定细胞株构建、基因编辑细胞模型构建；自主研发纳米抗体磁珠、标签抗体、互作试剂盒等科研试剂。

公司自建分子、细胞、蛋白完整实验平台，实验数据真实可靠。提供专业售前方案设计，持续跟进售后技术支持直至文章发表。众多合作客户已在Molecular Cancer、Nature Methods等高分期刊发表 IF＞30 研究成果。