中文标题：家蚕丝素基因启动子结合蛋白的新进展研究

发表期刊：Scientific Reports

影响因子：4.379

发表时间：2021年8月

合作单位：西南大学

运用技术：DNA pull down MS（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究背景

家蚕的丝腺是一种特殊的器官，它可以有效地合成丝素蛋白和丝胶蛋白，并纺出茧子。丝腺又分前丝腺、中丝腺和后丝腺，后丝腺是唯一合成丝素蛋白的部分。丝素蛋白是一种分泌性复合蛋白，约占丝绸纤维的75%，由丝素蛋白重链(FibH)、丝素蛋白轻链(Fibl)和 P25糖蛋白组成。那么，哪些因素直接参与了丝素蛋白合成调控呢？本研究聚焦调控丝素蛋白（fibH、fibL、P25)编码基因的启动子结合蛋白，利用DNA pull down MS技术筛选了幼虫第四次蜕皮期 (M4)和5龄幼虫第5天(L5D5)这两个具有代表性的发育阶段，从后丝腺中鉴定出大量fih、fibL和P25启动子的结合蛋白，并分析了M4和L5D5之间存在共同和独特结合蛋白，及它们的功能特征和相互作用关系，为了解丝蛋白基因的相关调节因子提供了新的见解。

● 研究结果

1. DNA pull down MS技术筛选目标启动子的相互作用蛋白

为了鉴定家蚕M4和L5D5后丝腺（图1a）中丝素基因启动子的结合蛋白，研究者首先查找了fibH、fibL和P25的潜在启动子序列，双荧光素酶实验确定了这些启动子序列的活性显著高于阴性对照（图1b，c）。之后，他们采用DNA pull down技术筛选这些启动子的结合蛋白。生物素化的fibH、fibL和P25 DNA探针分别与样本孵育后，与未生物素化探针孵育的对照组相比，M4或L5D5后丝腺的多个蛋白质有明显富集。

  图1

2. M4和L5D5发育阶段后丝腺中丝素基因启动子结合蛋白的比较                                                                 

对DNA pull down蛋白产物的质谱检测（LC-MS/MS）结果显示，M4和L5D5 PSGs中分别筛选到的fih启动子结合蛋白分别为198和330个, fibL启动子结合蛋白分别为292和305个, P25启动子结合蛋白分别为247和460个。值得注意的是， L5D5样本鉴定出的启动子结合蛋白比从M4的丰富很多，意味着L5D5阶段招募了更多的蛋白质来调节丝素基因的表达，是有效合成的关键时期。进一步的分析显示，M4和L5D5发育阶段中常见的fibH、fibL和P25启动子结合蛋白分别有109、156和158个（图2a）。对这些蛋白的KEGG分析发现它们主要参与了代谢途径（尤其是次级代谢产物的生物合成和不同环境中的微生物代谢）和遗传信息处理(尤其是内质网中的核糖体、蛋白酶体和蛋白质处理)（图2b）。图3绘制了不同发育阶段（图3a为M4，图3b为L5D5）3种启动子的结合蛋白在各主要KEGG pathway条目中注释到的数目差别。

图2

图3

3. 三种丝素蛋白基因启动子的共有结合蛋白分析

接着，研究者筛选了三个丝素基因启动子的共有结合蛋白，发现大多数结合蛋白是fibH、fibL和P25基因启动子共有的（图4a）。KEGG pathway分析显示，这些蛋白注释到6个主要的KEGG pathway，其中一些结合蛋白在M4和L5D4的PSG中都被发现（图4b）。两个发育阶段鉴定的启动子结合蛋白更多的注释到人类神经退行性疾病通路，如阿尔茨海默病和帕金森病等，其次是参与核糖体、内质网蛋白加工通路（图5）。之后，研究者又使用STRING工具分析了这些结合蛋白间的作用关系，并绘制了网络图。

图4

图5

4. 丝素蛋白基因启动子结合蛋白中的转录因子

转录因子对于丝素基因转录和蛋白质合成的调控是不可或缺的。本研究鉴定到共31个潜在的转录因子，分布在18条染色体上，这些转录因子在调节丝素基因表达方面的功能大多未见报道。值得注意的是，在M4和L5D5两个阶段都能与所有丝素基因启动子结合的转录因子共5个，只在M4或L5D5阶段可以与所有丝素基因启动子结合的转录因子分别为11个和10个，有5个转录因子只在M4阶段被富集，有9个转录因子只在L5D5阶段被富集。这些结果可能反映了转录因子调节三种丝素基因表达的异同，值得进一步研究。

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