中文标题：捕获新转录RNA的相互作用体，或促进对不同细胞和系统中总RNA结合蛋白质组的深入研究

发表期刊：Nature Methods

中科院分区：1区

影响因子：47.990

发表时间：2018年2月

合作单位：中国科学院广州生物医学与健康研究所

合作技术：辉骏生物为作者单位之一，为该项目提供部分技术服务

● 研究背景

目前系统研究RNA结合蛋白质组的方法主要是基于捕获多聚腺苷酸(PolyA)RNA，主要是带有寡聚(DT)包被珠的mRNA。然而PolyA尾巴只在新转录的RNA成熟的过程中被添加到RNA中，而一些成熟的mRNA要么是非PolyA的，要么是双态的。此外，成熟的非PolyA RNA物种占所有转录序列的很大一部分。捕获与所有类型RNA相互作用的RNA结合蛋白的方法不仅可以扩大我们目前对RNA相互作用组的看法，而且有助于理解非Polya RNA在生理和疾病中的功能。

● 研究结果

1. 利用RICK技术捕获新转录的RNA互作组

研究者用Eu标记HeLa细胞中的RNA，固定细胞后通过RICK反应使Eu生物素化，然后用链霉亲和素磁珠珠提取RNA-蛋白质复合物。凝胶电泳和银染证实RICK方法成功分离出与EU标记RNA直接相互作用的蛋白质；Western blotting验证了RICK法对已知RNA相关蛋白的捕获。

  图1

2. Rick捕获的RNA种类                                                                              

研究者对RICK RNA pull down技术捕获的样本进行了转录组测序(RNA-seq)，分析结果(图2A)与Castello的oligo(DT)捕获数据相比显示出明显的差异，在该数据中，捕获的RNA中80%是mRNA。接下来，研究者研究了RICK样本中的富集与三种相关的非PolyA RNA：circRNA、近端启动子RNA(ppRNA)和增强子RNA(ERNA)的oligo(Dt)捕获情况。在对ppRNA的评估中，与oligo(Dt)捕获相比，Rick样本中转录暂停基因(TR>4)在TSS周围积累了更高的RNA-seq信号，这表明仅通过Rick就能有效地分离ppRNA；而非暂停基因(TR<4)差异则很小(图2B，C)。此外，在RICK样本中，RNA-seq信号在假定的增强子区域16(6.05%)上有很强的富集，而在寡核苷酸(DT)捕获中几乎没有(0.11%)(图2D)。RT-qPCR进一步证实，与oligo(Dt)捕获相比，用RICK提取的非Polya RNA分离效果良好。简言之，除Polya RNA外，RICK还成功地分离出了其他各种RNA种类，表明它也可以富集不是通过寡核苷酸(DT)捕获方法分离的相关结合蛋白。

图2

3. RICK法分离蛋白质的特性研究

采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对RICK分离的蛋白质进行分析。与oligo(DT)捕获在不同条件下的比较表明，RICK分离了许多在oligo(DT)捕获研究中没有鉴定到的蛋白质）（图3B），这些差异既不是由于细胞培养、蛋白质组学程序的差异，也不是由Eu标记引起的（图3A）。

图3

4. RICK分离蛋白的功能分析

对295个RICK特有的RBP进行了GO分析，观察了与有丝分裂相关的生物过程的富集(图4A)。KEGG途径分析还将“细胞周期”列为前十个最显著富集的途径（图4B）。相反，对Rick鉴定的425种蛋白质进行的GO和KEGG分析显示，oligo（dT）捕获数据集中存在的蛋白质主要与RNA相关。综上所述，这些数据进一步加强了RICK在分离用寡核苷酸(DT)捕获方法未鉴定出的蛋白质方面的独特性，并揭示了RNA在意想不到的细胞过程中的功能。

图4

5. RICK识别与非polyA RNA优先结合的蛋白质

考虑到通过RICK 和oligo(DT)捕获分离的RNA种类的显著差异，295个RICK特有的RBP中有相当一部分可能优先与非polyA RNA结合。这种特异性可能是由于化学计量学、亚细胞定位或潜在的内在结合特异性。LC-MS/MS鉴定出914个高置信度蛋白质，称之为“PolyA缺失型RICK蛋白”。在这914个蛋白质中，576个与标准RICK程序的720个高置信度蛋白质重叠(图5A)。进一步分析表明，295个RICK特有的RBP中有204个(69.2%)与914个PolyA缺失型Rick蛋白重叠(图5B)。此外，在710个与RICK特有RBP不重叠的710个polyA缺失型RICK蛋白中，有563个出现在oligo(DT)捕获数据集中(图5B)，这表明这些蛋白具有结合PolyA和非PolyA RNA的混合趋势。这些结果表明，RICK可用于鉴定优先与非Polya RNA结合的蛋白质。

图5

6. 与METTL1和CDK1相互作用的RNA特性

我们选择了两个RICK特有的RBP METTL1和CDK1，用PAR-CLIP测序方法研究了它们相互作用的RNA。METTL1的两个独立PAR-CLIP测序实验显示捕获的RNA存在广泛重叠，其中很大一部分也被RICK捕获。进一步分析证实METTL1与tRNA显著结合，还与多种推测为非polyA的RNA结合，如内含子RNA和从基因间区域转录的RNA（图5C）。接下来，研究者使用随机六聚体或寡聚体（dT）引物进行RNA免疫沉淀（RIP），然后进行RT-qPCR，以识别METTL1靶RNA是否具有polyA尾巴。RIP-qPCR显示，使用随机六聚体富集了7个mRNA，而使用寡聚(DT)引物只能扩增出其中的3个，证实了METTL1与含有mRNA序列的非PolyA RNA结合(图5D)。CDK1 PAR-CLIP测序分析显示与转录自基因间区域和内含子RNA的RNA结合，与RICK捕获的RNA也存在广泛重叠。后续分析进一步表明，METTL1和CDK1广泛地与非PolyA RNA结合，暗示这两种蛋白的RNA相关功能被忽视。

7. 利用RICK捕获新生RNA互作组

研究者对HeLa细胞进行了短Eu标记(0.5、1和2小时)，以研究RICK是否可以捕获与新生RNA互作的蛋白。鉴定了208种不同的高置信度蛋白质(分别为149、119和143，作用时间分别为0.5、1和2小时)，称之为“新生富集RBP”和319种低置信度蛋白质(图6A)。对208个新生富集RBP进行的GO和KEGG通路分析显示，转录和RNA代谢相关术语显著丰富(图6B)。进一步的研究表明，新生RNA转录和局部代谢物产生之间存在联系，从而调节表观基因和潜在的表观转录基因。

图6

8. 利用RICK获取mESC总RNA互作组

为证明RICK可以应用于其他类型的细胞，研究者用链霉亲和素结合辣根过氧化物酶证实了Eu在mESC中的有效掺入，并进行了LC-MS/MS，鉴定出518个高置信蛋白和304个低置信蛋白。这518个高置信度蛋白质中有160个与Kwon等人报告的“mESC mRNA相互作用组”重叠，而358个是RICK独有的，因此将其称为RICK独有的mESC RBP。对这358个候选限制性商业惯例的GO分析显示，RNA结合或PolyA RNA结合术语丰富。在这358个蛋白中，有95个在mESC中的表达水平高于分化后的细胞，这表明mESC在自我更新或多能性方面具有潜在的作用。因此，RICK可以应用于HeLa以外的不同细胞类型；此外还需要进一步的研究来确定新发现的候选RBP在mESC自我更新/多能性中的作用。

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