中文标题：LncRNA FOXD3-AS1通过募集H3K27Ac促进 YBX1转录和鼻咽癌发展

发表期刊：Frontiers in Oncology

影响因子：4.7

发表时间：2021年7月

合作单位：中南大学湘雅三医院肿瘤科

运用技术：RNA pull down MS、RNA免疫沉淀（RIP）、LC-MS/MS质谱检测（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究背景

长链非编码RNA（lncRNA）可影响各种肿瘤的进展，包括鼻咽癌（NPC）。已有报道lncRNA FOXD3-AS1影响多种癌症的进展，生物信息学分析发现FOXD3-AS1在NPC组织中高度表达，并与NPC的恶性进展有关，但FOXD3-AS1影响NPC恶性进展的机制仍有待进一步探索。

● 研究结果

1、LncRNA FOXD3-AS1在鼻咽癌组织和细胞系中过表达

首先，研究者通过GSE数据集查找发现，FOXD3-AS1在NPC组织中的表达水平显著高于正常鼻咽组织（图1A、B）。其次，TCGA公共数据库也显示FOXD3-AS1在头颈部鳞状细胞癌和NPC组织中都有高表达（图1C、D）。RT-qPCR检测六种鼻咽癌细胞系（HNE1、HK1、HONE1、CNE1、CNE2和SUNE1，图1E）和正常鼻咽上皮细胞系（NP69，图1E），也发现FOXD3-AS1在NPC细胞系中表达显著上调（图1E）。LNCipedia数据库分析（图1F）和二级结构预测（图1G）证实FOXD3-AS1没有编码蛋白质的能力。

图1

2、LncRNA FOXD3-AS1体外促进鼻咽癌恶性进展

为了阐明FOXD3-AS1在NPC细胞系中的作用，在SUNE1和HONE1细胞中转染sh RNA质粒（shF1和shF2）敲低FOXD3-AS1的表达（图2A）。CCK-8测定和克隆形成实验结果表明FOXD3-AS1敲低导致NPC细胞增殖减少（图2B、C），Transwell结果显示敲低FOXD3-AS1导致NPC细胞迁移能力（图2D）和侵袭能力减弱（表2E）。

图2

3、LncRNA FOXD3-AS1特异性靶向YBX1并调控YBX1的表达

通过核质分离和FISH实验确定了FOXD3-AS1同时存在于NPC细胞的细胞核和细胞质中，但在细胞核里面的含量更高（图3A、B）。为了找到FOXD3-AS1的靶蛋白，研究者进行了RNA pull-down（图3C）和质谱(MS)分析鉴定（图3D），鉴定到潜在结合蛋白YBX1，RNA pulldown WB技术实验验证了FOXD3-AS1可以与YBX1结合（图E）。RNA免疫沉淀（RIP）qPCR实验操作再次确认了YBX1是FOXD3-AS1的靶蛋白（图F）。为了探讨FOXD3-AS1和YBX1的表达关系，在体外NPC细胞系中敲低FOXD3-AS1的表达后，发现YBX1的转录和翻译水平受到抑制（图3G，H）。当FOXD3-AS1过表达时，YBX1的转录和翻译水平也跟着上调（图3I，J）。

图3

4、LncRNA FOXD3-AS1通过募集H3K27ac调节YBX1的表达

为什么lncRNA FOXD3-AS1能调控YBX1的表达呢？生信分析发现YBX1的启动子可以结合H3K27ac（图4A）。为了验证这一点，研究者进行了H3K27ac的染色质免疫沉淀（ChIP）分析，YBX1启动子区qPCR产物的凝胶电泳结果显示，FOXD3-AS1敲低显著降低了YBX1启动子区的H3K27ac富集（图4B）。野生型和突变型YBX1的双荧光素酶实验结果表明，敲低FOXD3-AS1抑制了H3K27ac在YBX1启动子区的富集（图4D）。使用组蛋白乙酰转移酶的抑制剂C646阻断H3K27的乙酰化，发现YBX1的表达降低，表明H3K27ac会影响YBX1的表达（图4C）。这些实验结果表明FOXD3-AS1可以通过募集H3K27ac来调节YBX1的表达。

图4

5、YBX1可逆转lncRNA FOXD3-AS1敲低诱导的增殖、迁移和侵袭

为了研究FOXD3-AS1是否通过靶向YBX1促进肿瘤进展，在敲低FOXD3-AS的细胞中转染YBX1过表达质粒（图5A），经CCK8检测（图5B），克隆形成实验（图5C）和Transwell实验（图5D、E）发现，YBX1可以逆转FOXD3-AS1敲低对肿瘤的抑制作用。

图5

6、LncRNA FOXD3-AS1在体内促进NPC恶性进展

为了证实lncRNA FOXD3-AS1在NPC恶性进展中的作用，研究者将FOXD3-AS1敲低的NPC细胞和对照细胞注射到小鼠体内构建了肿瘤生长转移模型，结果显示FOXD3-AS1敲低组的移植瘤较小（图6A、B），重量较轻（图6C）且肺转移较少（图6D-F）。原位杂交结果显示FOXD3-AS1敲低组肿瘤组织中的FOXD3-AS1表达降低了（图6G，左）。免疫组化结果显示，FOXD3-AS1敲低组肿瘤组织中的YBX1表达也降低了（图6G,右）。

图6

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