标题：FOXC1-mediated LINC00301 facilitates tumor progression and triggers an immune-suppressing microenvironment in non-small cell lung cancer by regulating the HIF1α pathway.

期刊：Genome Medicine

影响因子：10.675

关键词：lncRNA，LINC00301，HIF1α，FOXC1，非小细胞肺癌

主要技术方法：RNA免疫共沉淀（RIP-qPCR），RNA pull down，EMSA，FISH，染色免疫共沉淀（ChIP-qPCR），双荧光素酶报告基因等。

非小细胞肺癌(NSCLC)仍然是全球癌症死亡的主要诱因之一，长链非编码RNA(LncRNA)在多种癌症的发生和转移中起着非常复杂的作用，可以作为预后或诊断的标志物。LINC00301在肺癌中的表达水平超过正常组织5倍多，但其在NSCLC中的详细分子机制仍不清楚。

2020年12月，武汉大学健康学院预防医学系的研究人员发现NSCLC中高表达的LINC00301与不良预后密切相关。体外实验表明LINC00301促进癌细胞增殖、侵袭和迁移，抑制细胞周期阻滞和凋亡。体内实验表明LINC00301靶向TGF-β募集Treg细胞，减少CD8+T细胞，发挥免疫抑制作用，增加致瘤性。从机制上讲，转录因子FOXC1促进LINC00301表达，LINC00301直接结合EZH2并增加EAF2启动子的H3K27me3修饰，进而调节EAF2/VHL/HIF1α途径促进NSCLC发展。此外，他们还发现LINC00301可作为“miRNA海绵”通过miR-1276-HIF1α信号轴发挥作用。

1.    LINC00301在NSCLC中高表达并促进肿瘤发展
数据库显示LINC00301在NSCLC中显著上调，120对临床样本的qRT-PCR检测确定了LINC00301在NSCLC显著上调，且与更差的预后有关。克隆形成、CCK8、Transwell、流式细胞检测等实验表明，过表达LINC00301可显著促进NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞周期阻滞和凋亡。小鼠移植瘤实验表明，LINC00301过表达导致肿瘤增大，移植瘤中Ki-67阳性细胞数量增加，表明LINC00301显著促进了致瘤性。接下来，研究者通过质谱流式细胞（CyTOF）和免疫荧光技术分析了LINC00301在小鼠肿瘤免疫细胞浸润中的作用，发现LINC00301抑制CD8+T细胞的浸润，促进CD+4 CD+25Treg细胞的浸润，提示LINC00301通过募集Treg细胞在非小细胞肺癌中发挥免疫抑制作用，或许可以作为识别ICI疗效的标志物。已知TGF-β1诱导CD4+Foxp3+Treg细胞的形成，作者检测发现，NSCLC细胞上清液中的TGF-β1水平高于正常，而LINC00301过表达又进一步增加了TGF-β1水平，表明LINC00301可促进NSCLC细胞分泌TGF-β1，驱动Treg细胞浸润，进而抑制肿瘤微环境中CD8+T细胞的数量。

2.    转录因子FOXC1调控LINC00301表达
为了确定LINC00301受哪些因素调控，首先检测了染色质甲基化和脱乙酰化这两类可以沉默或激活基因表达的因素，但发现它们并不参与对LINC00301的调控。接着在线预测了可能与LINC00301启动子结合的潜在转录因子，发现FOXC1在NSCLC中表达上调。荧光素酶报告分析与染色质免疫沉淀(ChIP)实验结果表明，FOXC1介导了NSCLC中LINC00301的上调。

3.    LINC00301招募EZH2到EAF2启动子并抑制其表达
FISH结果显示LINC00301在细胞核中的含量显著高于细胞质，推测LINC00301可能参与组蛋白甲基化。检测发现，LINC00301可特异性的增加H3K27二/三甲基化。H3K27二/三甲基化通常由PRC2催化，LINC00301的RNA免疫沉淀法(RIP)确定了PRC2元件“EZH2”和“SUZ12”被显著富集。RNA pull-down实验进一步证实，LINC00301在NSCLC细胞中与EZH2结合，但不与SUZ12结合。RNA pull down和RNA EMSA实验确定了LINC00301的83-123nt区域直接与EZH2的612–727 aa区域结合。对EZH2下游靶标的检测发现，LINC00301过表达显著抑制了EAF2的mRNA和蛋白水平。ChIP-qPCR也确定了EZH2可以直接与EAF2启动子区结合。这些结果表明：在NSCLC中，LINC00301结合并招募EZH2到EAF2启动子，增加EAF2启动子H3K27me3来抑制其表达。临床数据分析进一步证实了EAF2对NSCLC有抑制作用。

4.    LINC00301通过调节EAF2/VHL/HIF1α途径促进NSCLC发展
已知EAF2可以结合并稳定pVHL，进而促进HIF1α降解，保护细胞免受缺氧引发的细胞死亡。为了确定LINC00301是否参与这一过程，作者进行了过表达/干扰实验。结果显示，LINC00301显著抑制了EAF2和pVHL蛋白表达，增加了HIF1α蛋白表达。细胞实验表明，LINC00301的表达和EAF2的敲除加速了NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，临床样本检测发现，HIF1α在NSCLC中的水平显著高于正常组织，数据库分析表明高水平的HIF1α与改善的总生存期和无进展生存期显著相关。

5.    LINC00301还可作为miR-1276海绵促进HIF1α
由于LINC00301也存在于细胞质中，推测其也会通过细胞质途径发挥致癌作用。作者预测了LINC00301的潜在结合miRNA，并进行了RNA pull down实验，其中miR-1276被显著富集。双荧光素酶实验进一步确定了miR-1276可以在预测位点直接与LINC00301结合。miRNA靶基因预测提示HIF1α可能是miR-1276的潜在靶标，双荧光素酶实验确认了这一结果。对临床样本的检测表明，miR-1276不影响HIF1α的RNA水平，但抑制其蛋白水平。进一步的实验表明，LINC00301对HIF1α的促进作用可被miR-1276抑制，miR-1276对HIF1α的抑制也可因LINC00301加入而减轻；miR-1276通过直接靶向HIF1α抑制细胞增殖、迁移和侵袭。这些结果表明LINC00301的致癌功能和效率至少部分归因于miR-1276-HIF1α信号轴。

本研究阐明了LINC00301对NSCLC致癌作用的潜在机制，并揭示了LINC00301可能是一个有价值的生物标志物和可能的治疗靶点。