标题：METTL14-mediated N6-methyladenosine modification of SOX4 mRNA inhibits tumor metastasis in colorectal cancer.

期刊：Molecular Cancer

影响因子：10.679

关键词：METTL14，SOX4，H3K4me3，YTHDF2，结直肠癌

主要技术方法：转录组测序（RNA-seq），m6A RNA免疫沉淀测序（MeRIP-Seq），染色免疫共沉淀（ChIP-qPCR），RNA免疫共沉淀（RIP-qPCR），RNA稳定性实验，荧光素酶报告基因实验等。

      结直肠癌（CRC）的主要死亡原因是远处转移。甲基转移酶样蛋白14(METTL14)是一种主要的RNA N6-腺苷甲基转移酶，通过调节RNA功能参与肿瘤发展。本研究旨在揭示METTL14在CRC中的生物学功能及其分子机制。

       2020年6月，南京市第一医院综合临床研究中心的研究人员发现CRC中METTL14的表达下调且与总生存率差有关。KDM5C介导了METTL14启动子区域的H3K4me3，抑制了METTL14的转录。体外和体内实验表明METTL14抑制CRC细胞的迁移、侵袭和转移。METTL14可介导SOX4的m6A修饰，抑制其表达，该过程依赖于YTHDF2通路。 METTL14可能通过SOX4介导的EMT过程和PI3K/Akt信号部分抑制CRC的恶性过程。

1.    METTL14在CRC中低表达并促进肿瘤转移和发展
数据库分析发现METTL14在CRC中表达下调，qRT-PCR和IHC对临床样本的进一步检测表明，METTL14在CRC中显著下调，且与淋巴结转移、远处转移和TNM分期显著相关，低水平的METTL14患者表现出更差的生存期，暗示METTL14可能是一个独立的CRC预后指标。

2.    KDM5C介导的H3K4me3去甲基化抑制了METTL14的转录
通过对ENCODE中H3K4me3的CHIP-Seq数据查询发现，CRC细胞中H3K4me3在启动子区域的富集明显低于正常结直肠组织，KDM5C mRNA在CRC组织中显著上调，且与METTL14的水平呈负相关（已知KDM5C可催化H3K4me2/3去甲基化，抑制基因转录）。实验证明，KDM5C水平下降时，METTL14的RNA和蛋白水平均显著升高。KDM5C和H3K4me3的ChIP-qPCR结果均显示METTL14启动子区被显著富集，当干扰KDM5C后，可以明显增加METTL14启动子区的H3K4me3信号；因此推测KDM5C介导的H3K4me3去甲基化可能是引起METTL14表达下降的原因。

3.    METTL14抑制CRC细胞迁移和侵袭
对CRC细胞的qPCR检测再次确认了METTL14在CRC细胞中的低表达。细胞transwell和CRC细胞移植小鼠实验表明，METTL14高表达时，细胞迁移、侵袭及肿瘤转移力下降，METTL14低表达时结果相反。

4.    SOX4是METTL14的下游靶标
通过对sh-METTL14细胞的RNA-seq及MeRIP-seq检测，找到了在2组数据中重叠的25个转录本，并从中发现了已知的癌基因SOX4。RNA-seq结果显示，当METTL14敲低时，SOX4显著上调。MeRIP-seq结果显示，SOX4 mRNA的终止密码子附近检测到m6A峰，其在METTL14干扰时全部降低，暗示SOX4可能是METTL14介导的m6A修饰的下游靶标。数据库信息和qPCR/IHC实验证据均表明METTL14的表达与SOX4的表达呈负相关。

5.    METTL14通过m6A-YTHDF2依赖性途径抑制癌基因SOX4
MeRIP-qPCR确认了metl14过表达或干扰能显著增加或降低SOX4的m6A丰度。SOX4野生和突变（无法进行m6A修饰）载体的荧光素酶实验显示，METTL14干扰只增加了SOX4野生型的转录水平，而不影响突变型，说明SOX4水平受METTL14相关m6A修饰的调控。qPCR检测确认了稳定干扰METTL14能显著促进SOX4的前体和成熟体的RNA水平。用放线菌素D处理sh-METTL14细胞及对照细胞以阻断转录，结果显示SOX4前体和成熟mRNA在对照细胞中的半衰期明显短于在sh-METTL14细胞中的半衰期，表明m6A的修饰可能触发了SOX4前体的剪接和成熟体的降解。

据报道，YTHDF1/2/3作为m6A阅读器家族。YTHDF1/2/3的shRNA干扰实验发现，只有干扰YTHDF2时显著增加了SOX4的表达。YTHDF2抗体的RNA免疫共沉淀（RIP-qPCR）实验证实了SOX4是YTHDF2的靶标。以上结果表明，METTL14介导的m6A修饰通过依赖于YTHDF2的mRNA降解抑制了SOX4的表达。

6.    METTL14通过SOX4介导的EMT过程和PI3K/Akt信号抑制结直肠癌的恶性过程
过表达/干扰实验研究了SOX4在CRC中的致癌作用，transwell迁移和侵袭实验显示，SOX4干扰抑制了CRC的迁移和侵袭。接着细胞和小鼠实验探讨了METTL14和SOX4的关系，在METTL14过表达条件下再过表达SOX4时，SOX4过表达部分恢复了被METTL14上调抑制的细胞/肿瘤转移能力。

据报道，SOX4控制TGF-β诱导的上皮-间质转化(EMT)。本研究发现METTL14缺失促进EMT，而SOX4沉默可以逆转该促进作用，说明METTL14通过抑制SOX4介导的EMT过程影响细胞迁移和侵袭。

另据报道，SOX4还是MAPK、PI3K-Akt和Wnt信号的重要激活剂。本研究发现METTL14敲除激活了PI3K/Akt信号通路，而SOX4沉默部分逆转了该激活作用。LY294002是一种已知的PI3K化学抑制剂，可阻断PI3K/Akt信号，LY294002处理后细胞的p-Akt水平降低，细胞迁移和侵袭能力也大大降低，表明METTL14通过抑制SOX4介导的PI3K/Akt途径发挥功能。

本研究发现了新的METTL14/SOX4信号轴，其阐明了其对结直肠癌转移的影响，这将对进一步的结直肠癌研究和治疗提供帮助。