在蛋白互作研究中，精准筛选、验证目标蛋白的互作分子，是实验的核心重点，也是科研推进的主要难点。目前主流的蛋白互作研究体系遵循“高通量初筛—多层实验验证—锁定关键位点”的核心逻辑：首先借助IP-MS、Pull-down MS高通量技术，批量挖掘目标蛋白的候选互作分子；再通过CoIP、GST pulldown等经典实验分层验证，剔除假阳性结果，确认真实互作靶蛋白；可结合免疫荧光（IF）观测蛋白胞内共定位，进一步佐证互作真实性；最后通过构建蛋白截短突变体、点突变体，精准定位蛋白互作的核心关键区域。

辉骏生物结合多篇SCI经典文献，系统拆解IP-MS、Co-IP、GST Pull-down核心实验的设计思路与结果分析逻辑，手把手梳理蛋白互作筛选与验证完整流程，助力科研人员高效攻克实验难点、推进课题研究。如有相关实验技术疑问或实验服务需求，可随时咨询辉骏生物！

蛋白与蛋白互作研究思路

第一步，通过IP-MS实验，筛选出目标蛋白富集度最高的候选互作蛋白，完成“筛选”环节；

第二步，采用Co-IP、GST pull-down实验，对筛选出的候选蛋白与目标蛋白的互作关系进行验证，落实“验证”环节；

第三步，构建目标蛋白与互作蛋白的互作结构域，为“确证”互作核心位点奠定基础；

第四步，通过分段Co-IP实验进一步验证互作结构域，明确互作核心区域，完成“确证”环节，形成完整的蛋白-蛋白互作研究闭环。

IP-MS筛选互作蛋白应用案例

1、IP-MS筛选GSNOR的互作蛋白是NEDD4

第一步，IP-MS筛选GSNOR的互作蛋白

通过 anti-GSNOR IP-MS 技术鉴定 GSNOR 的相互作用蛋白，并结合数据库预测发现GSNOR的核心候选互作蛋白为NEDD4（图1A）。

第二步，验证GSNOR与NEDD4的相互作用

GST pull-down实验证实GSNOR与NEDD4存在直接相互作用（图1B）。

Co-IP实验在组织和细胞层面上进一步证实GSNOR与NEDD4存在相互作用（图1C、1D）。

图1 引自Tang X, Liu X, Sha X, et al. NEDD4-Mediated GSNOR Degradation Aggravates Cardiac Hypertrophy and Dysfunction. Circ Res 136(4):422-438(2025).

2、IP-MS筛选GCLM的互作蛋白是NKRF

第一步，IP-MS筛选GCLM的互作蛋白

通过anti-Flag-GCLM IP-MS（由辉骏生物提供技术）鉴定与GCLM相互作用的蛋白，分析显示GCLM与NKRF存在关联（图2a）。

第二步，验证GCLM与NKRF相互作用

CoIP实验表明GCLM和NKRF相互作用（图2b）。

GST pulldown实验也证实GCLM与NKRF互作（图2c）。

Co-IP、荧光共定位证明GCLM主要与细胞核中的NKRF相互作用（图2e、2f）。

图2 引自[辉骏生物客户文章] Lin JF, Liu ZX, Chen DL, et al. Nucleus-translocated GCLM promotes chemoresistance in colorectal cancer through a moonlighting function. Nat Commun 16(1):263(2025).  

3、IP-MS筛选STAMBPL1的互作蛋白是NRF2

第一步，IP-MS筛选STAMBPL1的互作蛋白

通过anti-STAMBPL1 IP-MS技术鉴定与STAMBPL1相互作用的蛋白（图3a），分析显示NRF2是STAMBPL1关键候选互作蛋白（图3b-c）。

第二步，验证STAMBPL1与NRF2相互作用

正反拉CoIP实验证实STAMBPL1与NRF2存在内源性相互作用（图3d-e）。

GST pull down实验进一步证实STAMBPL1与NRF2存在直接相互作用（图3f）。

免疫荧光共定位实验证明STAMBPL1与NRF2在RBE细胞的胞质及细胞核内均存在共定位现象（图3g）。

第三步，分子对接模拟验证二者结合位点

分子对接模拟构建STAMBPL1与NRF2蛋白结合预测模型（图3h），明确二者的潜在结合位点。

第四步，截短体实验验证蛋白结合区域

分别构建Flag-STAMBPL1、Myc-NRF2全长和截短体质粒，用于293T细胞转染实验（图3i）。

截短体Co-IP实验证实STAMBPL1的251–436氨基酸残基片段可与NRF2蛋白结合，NRF2的228–605氨基酸残基片段为结合STAMBPL1的核心区域（图3i）。

图3 引自Wang Z, Zhang Y, Shen Y, Zhu C, Qin X, Gao Y. Liquidambaric acid inhibits cholangiocarcinoma progression by disrupting the STAMBPL1/NRF2 positive feedback loop. Phytomedicine 136:156303(2025).

IP-MS技术路线

（1）总蛋白提取：收集细胞，用预冷的IP裂解液提取蛋白。

（2）Input样品制备：取30 μL裂解液作为input。

（3）总蛋白与抗体孵育：实验组加目标蛋白IP抗体、对照组加IgG抗体。

（4）proteinA/G磁珠与抗体结合：磁珠捕获蛋白复合物。

（5）蛋白清洗：去除未结合蛋白。

（6）蛋白洗脱：得到“蛋白-蛋白互作复合体”。

（7）质谱测序：质谱鉴定IP洗脱液蛋白成份。

图4 内源IP-MS技术路线图

内源Co-IP联合质谱鉴定时，常出现抗体轻重链污染问题~那么我们可以通过在样本中融合表达带有特定标签的诱饵蛋白，利用标签纳米抗体磁珠来进行IP实验。该方法能彻底避免轻重链污染，无论是WB还是质谱实验都是适用的。

辉骏生物现有 Flag/HA/V5/GFP/RFP 标签纳米抗体磁珠，有需要可联系。

图5 外源IP-MS技术路线示意图

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IP-MS蛋白质谱鉴定常见问题解析

Q1：胶染色方法或者深浅会不会影响质谱？

染色方法或染色程度不会影响质谱，但染色深浅反映了蛋白含量的高低，建议不要染色过度，否则容易造成误判；由于银染灵敏度高，如果银染条带很浅，表明蛋白量较低，鉴定到的蛋白数目可能偏少。

Q2：IP/pull down类样本跑SDS-PAGE胶质检后，如果判断是否能送样质谱？

（1）如果SDS-PAGE条带较少或较浅都可能导致鉴定蛋白偏少，可增加样本量再检测。

（2）若抗体轻重链污染严重，可切去对应条带，回收其余条带上机质谱。

（3）如果有明确的目标蛋白，请先做目标蛋白的western-blot来确定其是否存在。

（4）样本存在未知杂质会造成质谱与电泳结果偏差，您可联系我方售后技术支持解决。

Q3：Western-blot检测到的蛋白，为什么质谱检测不到？

（1）Western blot 依靠特异性抗体检测并放大目标蛋白信号，受背景蛋白干扰小；质谱需同步检测多种蛋白，低丰度目标蛋白易受高丰度蛋白影响，难以检出。

（2）质谱无法实现蛋白全覆盖检测，同一样本多次上机结果也会存在差异，蛋白低表达、IP 富集不佳时检出难度更高。

（3）常规质谱采用胰蛋白酶（酶切位点 K、R）酶解，蛋白序列中该位点数量异常会产生不适配肽段；小分子蛋白建议提前分析序列。

（4）检索数据库需包含目标蛋白序列，如病毒侵染细胞样本，需额外导入病毒蛋白序列方可完成鉴定。

辉骏生物质谱鉴定客户文献

1. Mex-3 RNA binding family member A (MEX3A)/circMPP6 complex promotes colorectal cancer progression by inhibiting autophagy. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2024. 1区, IF=52.7.
2. The EGR1-mediated lncRNA TENM3-AS1 potentiates gastric cancer metastasis via reprogramming fatty acid metabolism. 2025. 1区, IF=33.9.
3. The snoRNA-like lncRNA LNC-SNO49AB drives leukemia by activating the RNA-editing enzyme ADAR1. Cell Discovery. 2022. 1区, IF=33.5.