转录因子（TF）与顺式作用元件的互作，是基因转录调控的核心，广泛应用于肿瘤表观遗传、分子机制等研究领域，也是高分机制论文的研究重点。

对于SCI发表而言，单纯表型数据难以突破二区瓶颈，验证转录因子与启动子的互作关系，是冲刺一区及顶级子刊的核心条件。该研究分为两种模式：已知TF筛选下游启动子、已知启动子挖掘上游调控TF。

业内普遍结合三项实验构建完整验证体系：ChIP验证细胞内天然环境下蛋白与DNA的内源结合；DNA pull down验证体外直接物理互作；双荧光素酶实验检测转录调控激活/抑制功能。

辉骏生物结合多年项目经验，深度解析三项实验的操作难点与避坑要点，助力科研人员快速完成TF-DNA互作机制研究。如需相关技术咨询、实验外包及产品订购，可随时联系：4006991663！

转录因子与启动子DNA互作验证方法

1、DNA pulldown实验

DNA pull down是研究目标DNA与蛋白质相互作用的技术。通过在体外条件下制备生物素标记的目标DNA探针，来调取样本中与之结合的蛋白质，可以用来筛选未知结合蛋白，或验证预测的已知蛋白。

图1 DNA pull-down实验原理图-辉骏生物

2、ChIP实验

ChIP是研究目标蛋白质与DNA相互作用的技术。利用诱饵蛋白抗体来调取生物体内天然结合的诱饵蛋白及其结合DNA片段的复合体，进而通过测序寻找未知的结合DNA序列，或通过qPCR验证预测的已知DNA序列。

图2 ChIP实验原理图-辉骏生物

DNA pull down是体外验证目标DNA与预测蛋白间的结合，ChIP是体内验证目标蛋白与预测DNA间的结合。区别如下：

3、双荧光素酶报告基因实验

双荧光素酶报告基因检测系统是研究启动子转录活性与基因转录调控的常用技术，基于萤火虫与海肾两种荧光素酶的发光原理，以对应荧光素为底物催化氧化反应产生生物荧光，通过报告基因+内参基因双体系校正实验误差、精准反映基因表达水平与启动子活性。用于基因转录调控机制的验证与研究。

图3 双荧光素酶报告基因实验原理图-辉骏生物

转录因子与启动子DNA互作思路及应用案例

1、已知转录因子，寻找未知的启动子DNA研究思路

（1）先利用ChIP-seq等技术大规模筛选目标转录因子结合的DNA序列；

（2）通过功能分析确定这些基因与课题研究的相关性，筛选出几个待验证的靶基因；

（3）采用ChIP-qPCR等技术验证二者的结合关系;

（4）进一步明确结合的功能性，通过双荧光素酶报告基因实验确认转录因子对DNA启动子活性的调控作用，完善互作的功能意义。

文献应用案例解析-辉骏生物

该研究筛选并鉴定出MAP3K8启动子的核心候选转录因子STAT1，逐步验证了STAT1与MAP3K8启动子的特异性结合关系，明确二者的互作调控关联。

（1）ChIP-seq与MAPK通路相关基因重叠分析

通过ChIP-seq数据分析结合MAPK通路相关基因重叠筛选，鉴定出IL1A、MAP3K8、BDNF、MET共4个核心候选介导基因，明确其可介导STAT1与p38-MAPK通路的关联调控关系（图4a）。

（2）验证转录因子与启动子的相互作用

ChIP-qPCR证实转录因子STAT1与MAP3K8启动子存在相互作用（图4b）。

（3）双荧光素酶报告基因实验定位结合区域

双荧光素酶报告基因实验结果显示，包含TSS上游-450 bp至TSS序列的质粒，不影响STAT1过表达诱导的荧光素酶活性；而包含TSS上游-500 bp及更长序列至TSS的质粒，可显著增强STAT1过表达诱导的荧光素酶活性。结果表明，MAP3K8启动子上STAT1的结合区域位于TSS上游-2000 ~ -450 bp区间内（图4c）。

（4）JASPAR数据库预测结合位点

利用JASPAR数据库进行生物信息学分析，预测出MAP3K8启动子上转录因子STAT1的特异性结合位点（图4d）。

（5）位点突变验证

双荧光素酶报告基因实验证实STAT1结合位点突变后，STAT1过表达诱导的荧光素酶活性显著降低（图4e）。

图4 引自Lan W, Chen X, Yu H, et al. UGDH Lactylation Aggravates Osteoarthritis by Suppressing Glycosaminoglycan Synthesis and Orchestrating Nucleocytoplasmic Transport to Activate MAPK Signaling. Adv Sci (Weinh).

2、已知启动子DNA，寻找未知的转录因子的研究思路

第一步，通过DNA pull-down MS实验和/或数据库检索分析，筛选出可能与目标启动子DNA结合的候选转录因子，完成“筛选”环节；

第二步，通过Jaspar等数据库预测目标启动子与待测转录因子的潜在结合位点；

第三步，采用ChIP qPCR或DNA pull-down WB实验，捕获转录因子与目标DNA的复合物，排除非特异性结合蛋白，落实“验证”环节；

第四步，明确转录因子对目标DNA的特异性结合和调控作用，完成“功能确证”环节，形成完整的DNA-转录因子互作研究闭环。

文献应用案例1

该研究筛选并鉴定出PD-L1启动子的核心候选转录因子EED，逐步验证EED与PD-L1启动子的相互作用关系，明确二者的互作调控关联。

（1）DNA pull-down MS和数据分析筛选启动子结合的潜在转录因子

通过DNA pull-down MS（由辉骏生物提供技术服务）实验分析筛选鉴定出34个PD-L1启动子的潜在结合差异蛋白（DEPs），结合hTF-target数据库开展交叉验证分析，最终确定转录因子EED为核心候选因子开展后续机制研究（图5a）。

（2）转录因子EED的功能验证

WB、qRT-PCR、免疫荧光实验证实CXCL1可显著诱导EED表达与核转运，有效提升PD-L1启动子活性、促进PD-L1蛋白表达（图5b-d）；而敲低EED表达可部分逆转并消除CXCL1对PD-L1转录水平及蛋白表达的诱导调控作用（图5c、d）。

（3）JASPAR数据库预测结合位点

利用JASPAR数据库进行生物信息学分析，预测出PD-L1启动子区域存在EED的特异性潜在结合位点（5'-GTTCCACTC-3'，−437 ~ −429bp）（图5e）。

（4）验证转录因子与启动子相互作用

ChIP-qPCR实验证实转录因子EED与PD-L1启动子存在特异性相互作用；同时验证CXCL1可显著增强EED与PD-L1启动子的结合能力，而敲低EED可有效削弱并部分消除二者的结合互作关系（图5e）。

（5）位点突变结合功能验证

双荧光素酶报告基因实验证实PD-L1启动子上EED的结合位点进行反义突变后，可显著阻断并消除CXCL1对PD-L1启动子活性的诱导激活作用（图5f）。

图5 引自[辉骏生物客户文章] Wang S, Li J, Hong S, et al. Chemotherapy-elicited extracellular vesicle CXCL1 from dying cells promotes triple-negative breast cancer metastasis by activating TAM/PD-L1 signaling. J Exp Clin Cancer Res 43(1):121(2024).

文献应用案例2

该研究筛选并鉴定出可结合CLC-3启动子的核心候选蛋白XRCC5，逐步验证了XRCC5与CLC-3启动子的特异性结合关系，明确二者的互作调控关联。

（1）DNA pull-down MS鉴定筛选CLC-3启动子结合候选靶蛋白

通过质谱鉴定（由辉骏生物提供技术）分析筛选确定XRCC5为CLC-3启动子的候选结合靶蛋白（图6a、6b）。

（2）验证蛋白与启动子的结合作用

DNA pull-down WB实验证实XRCC5能够与CLC-3启动子发生特异性结合，明确了XRCC5与CLC-3启动子的相互作用关系（图6c）。

（3）进一步验证XRCC5与CLC-3启动子的相互作用

ChIP实验进一步在证实XRCC5与CLC-3 DNA在各类细胞中均存在相互作用，且正常细胞中二者的结合量最低（图6d）。

图6 引自Gu Z, Li Y, Yang X, et al. Overexpression of CLC-3 is regulated by XRCC5 and is a poor prognostic biomarker for gastric cancer. J Hematol Oncol 11(1):115(2018).

辉骏生物试剂盒产品和服务