基因表达调控是各类生命活动的核心基础，转录因子（TF）是关键调控蛋白。其可特异性结合基因启动子、增强子等DNA元件，调控基因转录与表达强度，构建基因调控网络，是基因功能与分子机制研究的核心靶点。

完成目标DNA片段（多为基因启动子）功能验证后，筛选鉴定其结合的转录因子，是解析DNA调控机制、阐明基因上游通路的核心关键步骤。科研实验中，常因候选因子筛选混乱、非特异性结合无法去除、实验设计不规范等问题，导致数据重复性差、难以满足SCI发表要求。

目前SCI通用的转录因子筛选体系，遵循初筛候选—精准验证—锁定靶点的标准化流程：通过数据库预测、DNA pull-down MS体外高通量筛选候选转录因子，再结合ChIP-qPCR体内实验验证DNA-蛋白特异性互作，剔除假阳性蛋白，精准锁定靶向结合的转录因子。

辉骏生物结合高分SCI文献，详解转录因子筛选、鉴定、验证全套方法，拆解DNA pull-down、ChIP核心实验的设计思路、操作要点与结果分析逻辑，总结实验误区与优化方案，助力科研人员快速完成标准化实验、产出可发表数据；专业技术团队提供一对一答疑服务！

目标DNA结合转录因子研究思路

目标DNA结合转录因子筛选思路遵循“筛选-验证-确证”的完整研究体系：

第一步，通过DNA pull-down MS实验和数据库检索分析，筛选出可能与目标启动子DNA结合的候选转录因子，完成“筛选”环节；

第二步，通过Jaspar等数据库预测目标启动子与待测转录因子的潜在结合位点；

第三步，采用ChIP-qPCR实验，捕获转录因子与目标DNA的复合物，排除非特异性结合蛋白，落实“验证”环节；

第四步，明确转录因子对目标DNA的特异性结合和调控作用，完成“功能确证”环节，形成完整的DNA-转录因子互作研究闭环。

转录因子预测及结合位点验证应用案例

案例1：TRIM34的转录因子是YY1

图1 引自Yao F, Zhou S, Zhang R, et al. CRISPR/Cas9 screen reveals that targeting TRIM34 enhances ferroptosis sensitivity and augments immunotherapy efficacy in hepatocellular carcinoma. Cancer Lett 593:216935(2024). 

（1）转录因子筛选：在PROMO、hTF target、Human TFDB和GTRD数据库中搜索可能激活TRIM34转录的转录因子，确定四个候选因子：YY1、TBP、AR和POU2F1（图1A）。

（2）qRT-PCR和WB实验：表明YY1敲低显著降低HCC细胞中TRIM34的表达，YY1成为可能调控TRIM34的转录因子（图1B和C）。

（3）TCGA数据分析YY1与TRIM34表达相关性：结果显示YY1和TRIM34的mRNA水平呈正相关（图1D），并在HCC组织样本中得到进一步验证（图1E）。

（4）Jaspar数据库预测：显示TRIM34启动子中潜在的YY1结合位点（YBS），发现该基因组片段中存在两个预测的YBS（图1G）。

（5）ChIP-qPCR实验：证实YY1与TRIM34启动子区域存在相互作用（图1F）。

（6）双荧光素酶报告基因实验：结果表明YBS1突变消除了YY1上调TRIM34转录的能力，证实YY1通过与TRIM34启动子相互作用刺激TRIM34转录，进而导致HCC中TRIM34过表达（图1H）。

案例2：SHANK3的转录因子是YBX1

（1）探针设计：设计三个潜在转录因子探针，用于DNA pull-down实验（图2a）。

（2）DNA pull-down MS（由辉骏生物提供技术服务）筛选转录因子：对DNA pull-down复合体进行质谱检测，将实验组数据扣除对照组数据，得到目标DNA的结合蛋白列表，通过生信分析筛选其中的转录因子，发现转录因子YBX1位于排序表的首位（图2b和2c）。

（3）ChIP-qPCR实验：证实YBX1与SHANK3启动子的HyperM区域存在相互作用（图2d）。

（4）用shRNA敲低转录因子YBX1的表达后，SHANK3的水平也下降了，表明YBX1能结合SHANK3启动子并下调其表达。

图2 引自[辉骏生物客户文章] Ni P, Zhou C, Liang S, et al. YBX1-Mediated DNA Methylation-Dependent SHANK3 Expression in PBMCs and Developing Cortical Interneurons in Schizophrenia. Adv Sci (Weinh) 10(20):e2300455(2023). 

案例3：PD-L1的转录因子是EED

（1）DNA pull-down MS和数据分析：筛选到PD-L1启动子的潜在结合蛋白（DEPs）共34个，通过hTF-target数据库交叉分析，从中确定了一个转录因子EED进行后续研究（图3a，由辉骏生物提供技术服务）。

（2）功能实验：发现CXCL1可显著诱导EED的表达和入核，促进PD-L1启动子活性和蛋白表达（图3b-d）；而敲低EED可部分消除CXCL1诱导的PD-L1转录和蛋白表达（图3c，d）。

（3）JASPAR数据库预测转录因子结合位点：结果显示PD-L1启动子区域存在一个潜在的EED结合位点（5'-GTTCCACTC-3'，−437 ~−429bp）（图3e）。

（4）ChIP-qPCR实验：证实EED与PD-L1启动子存在相互作用，且CXCL1可显著促进EED与PD-L1启动子的结合；而敲低EED可部分消除二者间的相互作用（图3e）。

（5）启动子结合区域突变实验：表明EED与PD-L1启动子的结合区域发生反义突变后，可显著消除CXCL1对PD-L1启动子活性的的诱导作用（图3f）。

图3 引自[辉骏生物客户文章] Wang S, Li J, Hong S, et al. Chemotherapy-elicited extracellular vesicle CXCL1 from dying cells promotes triple-negative breast cancer metastasis by activating TAM/PD-L1 signaling. J Exp Clin Cancer Res 43(1):121(2024).

DNA pull down和ChIP技术简介

DNA pull down实验

DNA pull down是研究目标DNA序列与蛋白质相互作用的技术。通过在体外条件下制备生物素标记的目标DNA探针，来调取样本中与之结合的蛋白质，可以用来筛选未知结合蛋白，或验证预测的已知蛋白。

图4 DNA pull-dwon实验技术流程图

ChIP实验
ChIP是研究目标蛋白质与DNA相互作用的技术。利用诱饵蛋白抗体来调取生物体内天然结合的诱饵蛋白及其结合DNA片段的复合体，进而通过测序寻找未知的结合DNA序列，或通过qPCR验证预测的已知DNA序列。

图5 ChIP实验技术流程图

DNA pull-down和ChIP实验常见问题

1、DNA探针标记用脱硫生物素还是不脱硫生物素？

脱硫生物素标记的DNA探针结合力强一点，但不易洗脱；不脱硫生物素标记的探针结合稍差一点，但容易洗脱。两者都可以用，但考虑到最终都要洗脱下来做实验，而不脱硫的探针简单且成本低，所以应用更广泛。

2、DNA pull-down实验是否一定要提核蛋白做？

DNA pull-down实验是否一定要提核蛋白做？最好提取核蛋白，但如果碰到动植物组织等样本核蛋白提取比较难或提取效率低的情况，可以直接提总蛋白做。因为高灵敏度的质谱仪可以保证低丰度的核蛋白不漏检，而生信分析也可以帮助寻找数据中的核蛋白和转录因子。

* 辉骏生物深耕蛋白检测10多年，可以提供高效的质谱检测服务。

3、ChIP关于抗体有何要求？如何选择？

ChIP实验中的抗体对于特异性、亲和力、效价都具有较高要求，能够成功用于WB、IHC等实验的抗体并不确保能成功运用于ChIP，因此需要选用经过ChIP验证的商品化抗体，这类抗体常会标明ChIP grade。

关于单抗和多抗。单抗具有特异性优势，但风险在于其识别表位可能恰好被掩蔽（DNA或交联环节），而多抗可识别多个表位可基本避免该风险。因此单多抗各有优缺点，应重点关注该抗体是否经过ChIP验证。

4、所研究的蛋白难以找到ChIP级抗体怎么办？

较常用的方式可以将目的蛋白同某种标签融合表达，比如HA、GFP、Flag等标签，使用这些标签抗体的ChIP级抗体，这种途径也常见于发表文献中。

辉骏生物现有 Flag/HA/GFP/RFP 4款类型的标签ChIP试剂盒，有需要的小伙伴可以联系！

5、染色质片段大小在哪个范围比较合适？

对于ChIP-seq，打断后的DNA电泳主带在200~500bp范围内，主峰在200~300bp是最合适范围；对于ChIP-qPCR，打断后的DNA片段在300~1000bp左右适宜。

6、ChIP实验如何设置对照及重复？

通常ChIP过程产生3份DNA产物，Input、IgG产物、IP产物。Input是染色质片段化后提取获得的总DNA、未经抗体加入免疫沉淀过程，IgG组这是用实验抗体的同型阴性对照抗体（作为mock IP），IP产物即是以实验抗体获得的免疫沉淀产物。

在后续的qPCR检测中，通常将IgG产物组作为IP产物组的对照。如需设置阳性对照抗体，可以选择Histone H3或者RNA polymerase II，然后以GAPDH或Actin等作为检测基因。

在后续的Sequence中，通常将Input组产物作为测序对照样品。

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辉骏生物实验服务优势

辉骏生物拥有十余年分子互作实验技术积淀，专注为DNA-蛋白、蛋白-蛋白、RNA-蛋白互作课题提供一站式全流程解决方案。可提供DNA pull-down、ChIP实验技术服务与配套试剂产品。从实验设计、实操检测到文章发表提供全程技术支撑，累计协助客户发表百余篇国际高水平SCI期刊成果。

全链条技术&产品支持

1. 高特异性纳米抗体磁珠（Flag/HA/V5/GFP/RFP）、IP 专用二抗（VHH 抗鼠）及各类标签 / 内参抗体；

2.全套蛋白互作实验服务：RIP、RNA pull down、ChIP、DNA pull down、Co-IP 等；

3.深度蛋白检测服务：IP 样本蛋白鉴定、蛋白修饰鉴定、蛋白组学等。

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