蛋白质相互作用（PPI）是细胞信号调控与分子机制研究的核心内容，广泛应用于肿瘤、免疫及基础生物学研究。科研中常因实验设计不规范、对照缺失、机制逻辑不完善，导致 PPI 实验重复性低、数据质量差。

依托15年平台实操经验与高分文献实验范式，辉骏生物整理六大标准化 PPI 研究体系，覆盖二元互作验证、多蛋白互作分析、结合结构域鉴定、甲基化 / 泛素化修饰机制研究，一站式解决六大核心科研问题：

1.体内外联合验证双蛋白真实物理结合

2.验证内外源调控因子对蛋白互作强度的影响

3.同步检测单一蛋白与两种靶蛋白的互作模式

4.截短体实验定位蛋白互作关键结构域

5.靶蛋白甲基化修饰定量检测与机制探究

6.靶蛋白泛素化修饰表征及功能解析

辉骏生物标准化梳理 Co-IP、GST Pull-down 分组方案、实验质控与定量判读逻辑，搭建完整闭环 PPI 验证体系，为各科研单位提供稳定规范的蛋白互作整套实验解决方案。

蛋白互作验证实验方法

Co-IP实验
Co-IP是利用“抗原-抗体”之间免疫结合的原理，在IP实验过程中保持目标蛋白同其互作蛋白的结合状态，使目标蛋白的互作蛋白共同被沉淀收集；

图1 Co-IP实验原理图

pull-down实验

pull down一般指将目标蛋白通过GST、His等标签挂于树脂/磁珠，利用“蛋白标签-配体”之间的亲和作用原理，将带标签的目标蛋白纯化出来，再与待测的样本裂解液孵育，将裂解液中的互作蛋白调取下来。

图2 pull-down实验原理图

简单来说，Co-IP捕获目的蛋白及其互作蛋白，pulldown用融合标签的重组蛋白来捕获其互作蛋白。具体区别如下：

蛋白互作应用案例

1、验证2个蛋白存在互作

一般通过体内Co-IP和体外Pull-down实验来共同验证2个蛋白相互作用。该研究通过体内Co-IP联合体外GST pull-down实验共同验证FBXO7与PRMT1的蛋白相互作用。

正拉Co-IP实验以IgG为阴性对照、PRMT1为实验组，WCL为样本总蛋白，目的看蛋白是否表达，均显示有条带，表明各组目的蛋白成功表达。PRMT1抗体IP下拉产物中可有效富集PRMT1蛋白，同时检测到FBXO7蛋白条带，证实PRMT1与FBXO7存在相互作用（图3c）。

反向Co-IP实验进一步验证二者互作，实验同样设置IgG为阴性对照、FBXO7为实验组，采用FBXO7抗体进行IP下拉。结果显示，FBXO7抗体可下拉富集到PRMT1蛋白，说明二者存在相互作用（图3d）。

体外GST pull-down实验验证二者的直接相互作用，实验以空载GST蛋白为对照、GST-FBXO7融合蛋白为实验组，His-MBP-PRMT1为待测互作蛋白。结果显示，GST-FBXO7融合蛋白可有效下拉His-MBP-PRMT1蛋白，而对照组无特异性条带，证实GST-FBXO7融合蛋白与His-MBP-PRMT1蛋白存在直接相互作用（图3g）。

图3 引自FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma. Nat Commun 15(1):4790(2024). 

2、研究某因素对两个蛋白结合的影响

利用Co-IP实验检测某因素对2个蛋白结合量的变化。该研究通过Co-IP检测Flag-MVP蛋白对HA-ASK1与His-TRAF6相互作用的调控效果。实验设置多组对照排除实验干扰：

①组为空白对照组，

②组仅转染Flag-MVP质粒，

③组仅转染HA-ASK1质粒，

④组仅转染His-TRAF6质粒（四组为IP对照组）；

⑤组共转染HA-ASK1与His-TRAF6质粒，

⑥组共转染Flag-MVP、HA-ASK1与His-TRAF6三种质粒（两组为IP实验组）。

Input结果显示，各质粒转染组均检测到对应目的蛋白条带，证实各外源蛋白均成功表达，可用于后续互作检测。

IP实验采用HA抗体进行下拉富集，⑤⑥组能富集到HA-ASK1蛋白，显示有条带，表明IP实验成功。IP实验结果显示，⑤组可通过HA-ASK1下拉富集到His-TRAF6蛋白，证实ASK1与TRAF6存在相互作用；而共转Flag-MVP的⑥组中，His-TRAF6特异性条带完全消失，表明Flag-MVP过表达可显著抑制ASK1与TRAF6的蛋白相互作用。

图4 引自Liu Q, Pan J, Bao L, et al. Major Vault Protein Prevents Atherosclerotic Plaque Destabilization by Suppressing Macrophage ASK1-JNK Signaling. Arterioscler Thromb Vasc Biol 42(5):580-596(2022).

3、验证1个蛋白与另外2个蛋白存在互作

利用CoIP同时验证1个蛋白与另外2个蛋白的之间的相互作用。该研究同时验证Pit1分别与RGA4、Pit2的蛋白相互作用。实验设置两组对照体系，第①组共转Pit1-HA质粒与RGA4-myc质粒，第②组共转Pit1-HA质粒与Pit2-myc质粒。

Input样本结果显示，各组均检测到对应的目的蛋白条带，证实所有外源质粒均成功表达目的蛋白；同时实验结果发现，转染RGA4质粒的样本未检测到Pit2蛋白条带，转染Pit2质粒的样本未检测到RGA4蛋白条带，二者互为阴性对照，排除了质粒交叉表达对实验结果的干扰。

IP实验采用HA抗体进行下拉富集，各组IP产物中均能检测到Pit1-HA蛋白条带，表明IP实验成功。IP结果显示，第①组样本中未检测到RGA4-myc特异性条带，表明Pit1与RGA4不存在蛋白相互作用；第②组样本可检测到Pit2-myc特异性条带，证实Pit1与Pit2存在相互作用。

综上，Pit1-HA与Pit2-Myc存在相互作用，与RGA4-Myc无相互作用。

图5 引自Li Y, Wang Q, Jia H, et al. An NLR paralog Pit2 generated from tandem duplication of Pit1 fine-tunes Pit1 localization and function. Nat Commun 15(1):4610(2024).

4、验证蛋白互作结构域

（1）Co-IP体内验证蛋白结合的结构域

该研究通过CoIP实验体内验证FBXO7与PRMT1的结合结构域。实验以Flag-FBXO7为诱饵蛋白，GFP-PRMT1为待测蛋白，首先构建了PRMT1的多种截短体用于后续实验（图6h）。实验设置共转染GFP-PRMT1全长与Flag-FBXO7为对照组，共转染GFP-PRMT1不同截短体与Flag-FBXO7为实验组。

IP实验采用Flag抗体进行下拉富集，各组IP产物中均能检测到Flag-FBXO7蛋白条带，表明IP实验成功。IP结果显示，Flag-FBXO7可下拉富集到PRMT1全长蛋白，表明FBXO7与PRMT1存在相互作用。截短体结合实验结果表明，PRMT1的1-22位氨基酸截短体无法与FBXO7结合，条带消失，提示该片段并非二者的结合区域；而PRMT1其余两段截短体均可与FBXO7正常结合，显示有条带，明确了FBXO7与PRMT1的结合功能区域。

J图进一步验证发现Flag-FBXO7与PRMT1的23-162这一段截短体是有结合的；而缺失这一段之后，条带消失，说明这一段就是结合的区域。

图6 引自FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma. Nat Commun 15(1):4790(2024).

（2）GST Pull-down体外验证蛋白结合的结构域

该研究通过GST Pull-down体外验证USP5与PD-1的蛋白结合的结构域。实验设置GST空载蛋白为对照组，以GST-USP5全长蛋白及不同截短体蛋白为实验组。

WCL组可检测到HA蛋白条带，银染结果证实各组GST空载蛋白、GST-USP5全长及截短体蛋白均成功纯化表达，可用于后续结合实验分析。

Pull-down实验洗脱结果显示，GST-USP5全长蛋白可有效富集PD-1-cHA蛋白，证实USP5与PD-1存在直接的体外相互作用；而缺失UBA1/2结构域的USP5截短体无法富集PD-1-cHA蛋白，结合条带完全消失，表明USP5的UBA1/2结构域是其与PD-1蛋白结合的核心区域。

图7 引自Xiao X, Shi J, He C, et al. ERK and USP5 govern PD-1 homeostasis via deubiquitination to modulate tumor immunotherapy. Nat Commun 14(1):2859(2023).

5、验证蛋白甲基化修饰水平

该研究通过Co-IP检测FBXO7对内源PHGDH甲基化修饰水平的调控作用。实验设置shScramble作为阴性对照组，两种FBXO7敲除细胞系作为实验组。

WCL样本结果显示，各组目的蛋白均有蛋白条带，证明样本中蛋白表达正常；且相较于对照组，实验组FBXO7蛋白条带显著减弱，证实FBXO7敲除细胞系构建成功，可用于后续实验分析。

IP实验利用PHGDH抗体进行下拉富集，结果显示，相较于对照组，FBXO7敲除细胞系中PHGDH甲基化位点条带显著加深，表明敲除FBXO7可显著促进PHGDH的甲基化修饰水平。同时，各组PHGDH总蛋白条带无明显差异，提示敲除FBXO7不影响PHGDH的本底表达水平。

图7 引自FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma. Nat Commun 15(1):4790(2024).

6、验证蛋白泛素化修饰水平

该研究通过Co-IP实验检测FBXO7对外源表达PRMT1蛋白泛素化修饰水平的影响。实验以GFP-PRMT1为待测蛋白、Flag-FBXO7（野生型及突变型）为诱饵蛋白，同时引入带HA标签的泛素蛋白（HA-Ub）用于指示蛋白泛素化修饰水平。对照组共转染Flag空载、HA-Ub与GFP-PRMT1质粒，实验组分别共转染Flag-FBXO7野生型/突变型、HA-Ub与GFP-PRMT1质粒。

IP实验通过GFP抗体下拉富集GFP标记的PRMT1蛋白，检测其泛素化修饰水平变化。IP结果显示，第2个泳道可检测到明显的HA条带，证实PRMT1蛋白本身存在基础水平的泛素化修饰；第3个泳道过表达野生型Flag-FBXO7后，HA条带显著加深，表明FBXO7可显著促进GFP-PRMT1的泛素化修饰水平。而第4个泳道转染Flag-FBXO7突变体后，HA条带无明显变化，进一步证实野生型FBXO7可特异性介导并促进PRMT1蛋白的泛素化修饰，突变型FBXO7则丧失该调控功能。

图8 引自FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma. Nat Commun 15(1):4790(2024).

Co-IP、pull-down实验常见问题

1、Co-IP/Pull-down实验无互作条带、靶蛋白拉不下来是什么原因？

首先排查蛋白互作本身，部分蛋白互作属于弱瞬时互作，常规实验条件难以捕获。其次大概率是实验体系问题，裂解液若使用SDS等强变性去污剂，会直接破坏蛋白天然结合结构，彻底打断蛋白互作。

同时抗体选择不当、孵育时间过短、磁珠/琼脂糖珠用量不足，也会导致诱饵蛋白富集量低，无法抓取靶蛋白。另外，蛋白降解、样本反复冻融，会造成诱饵蛋白流失，最终出现无条带的情况。优化核心是选用NP-40等温和非变性裂解液，使用IP级抗体，充足孵育并优化磁珠用量。

2、Co-IP/Pull-down实验条带杂带多、背景极高如何解决？

高背景是该类实验最常见问题，核心原因是非特异性吸附过多。一是磁珠/树脂本身会非特异性结合杂蛋白；二是洗涤条件过于温和，洗涤次数少、洗涤液盐浓度和去污剂浓度过低，无法清洗杂蛋白；三是样本中存在未裂解完全的蛋白复合物、细胞碎片残留。

常用解决方案是实验前用空白珠子对样本进行预清除，增加洗涤次数、梯度提升洗涤液严谨度，同时样本裂解后短暂超声、高速离心取上清，去除杂质干扰。

3、Co-IP实验出现严重的抗体轻重链污染怎么办？

进行IP洗脱步骤的时候，诱饵蛋白、互作蛋白洗脱下来同时， 四聚体形式的IP抗体也会被一同洗脱下来，WB检测时会出现明显重链和轻链条带，严重干扰靶蛋白条带判读，尤其会影响后续质谱鉴定结果。

图9 IP抗体轻重链示意图

对于抗体轻重链污染问题，我们还能帮您解决麻烦：

1. 标签Co-IP：选择标签纳米抗体磁珠（Flag，HA，V5，GFP，RFP可选）；

2. 内源Co-IP：选择IP专用二抗。

有需要可以联系辉骏生物~

辉骏生物纳米抗体磁珠及IP试剂盒

辉骏生物pull-down纯化树脂及试剂盒

以上是本期的主要内容~

辉骏专注蛋白互作十余载，提供各种类型纳米抗体磁珠（Flag，HA，V5，GFP，RFP）、IP专用二抗（VHH抗鼠）、标签抗体、内参抗体、蛋白互作试剂盒以及互作实验服务（RIP、RNA pull down、ChIP、DNA pull down、Co-IP实验）和蛋白检测服务（IP样本的蛋白鉴定，蛋白修饰鉴定、蛋白组学等）。

辉骏生物简介

广州辉骏生物科技股份有限公司（Fitgene）成立于2011年，超15年科研服务经验，专业提供蛋白（抗体）和互作实验服务，包括蛋白质谱检测、蛋白/RNA/DNA/化合物等分子间相互作用检测、抗体稳定表达株构建、基因敲除和过表达细胞株构建等；同时还研发了纳米抗体磁珠、IP专用二抗、互作试剂盒、标签抗体等科研产品。

公司自有分子、细胞和蛋白等实验平台，服务经验丰富，保证结果真实、可靠！我们不仅会提供专业的售前方案建议、而且售后技术支持将一直保持到文章发表，确保您安心进行下游实验及投稿。

目前，客户已在Signal Transduction and Targeted Therapy (IF: 52.7)、Journal of Hematology & Oncology (IF: 40.4)、European Heart Journal (IF: 35.7)、Molecular Cancer (IF: 33.9)、Cell Discovery (IF: 33.5)、Nature Methods (IF: 32.1)等高水平期刊成功发表大量高分文章。