制备带标记的RNA探针是RNA pull down实验中最开始、也是最关键的步骤。

首先确定目标序列。根据实验目的确定合适的RNA序列，可以是目标转录本的全部序列或部分序列；对照组通常采用反义序列，也可以是无关序列。如果目标序列小于100bp，建议直接合成带标记的RNA，如果大于100bp，可以按照如下步骤体外转录获得。

1. 制备带有T7启动子和目标序列的DNA模板。通过PCR或全基因合成方法获得目标序列，例如测序验证过的纯化PCR产物或质粒。以此为模板，设计带有T7启动子（TAATACGACTCACTATAGGG）的引物，PCR分别获得T7-正义链（实验组）和T7-反义链（对照组）DNA模板并回收纯化。

2. 体外转录得到标记的RNA探针。以带有T7启动子的DNA为模板，采用体外转录试剂盒进行转录，生成RNA。为了进行后续RNA pull down实验，同时对RNA进行标记。

RNA pull down实验常常采用生物素标记目标RNA，基于生物素与链霉亲和素之间的强大亲和力，用链霉亲和素磁珠捕获RNA探针的互作复合体。

生物素标记RNA的常见做法是在转录体系中加入生物素标记的UTP，边转录边标记，但标记效率会随着序列的长度增加而逐渐下降，因此不同RNA序列获得的探针量不稳定。标记好的生物素RNA还需要纯化以去除游离的生物素UTP，纯化过程中也会有一些RNA损失。

为解决RNA探针标记的难题，辉骏生物研发了一种新的标记方法，利用一段只有16nt的RNA标签“F2”来标记RNA。磁珠上偶联的特异性配体与F2标签具有强大的亲和力，可以高效调取目标RNA。该方法的最大优势是：在构建DNA模板时即可以将F2与目标序列连接，省去了转录时的标记步骤，实现了100%标记，不仅可以标记线性RNA，还可以标记环状RNA（circRNA），并能灵活的进行体内、体外标记。除此之外，省去了标记后的RNA纯化步骤，避免了RNA损失、操作更加简单，降低了成本。目前该方法已经获得国家专利授权。

F2 RNA pull-down试剂盒使用案例

左：RNA pull down WB检测图（阳性）；    右：RNA pull down MS产物银染图

F2-RNA pull down试剂盒产品信息-辉骏生物

RNA pull down实验—辉骏服务内容

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客户文章：

1. Fumarate induces LncRNA-MIR4435-2HG to regulate glutamine metabolism remodeling and promote the development of FH-deficient renal cell carcinoma. Cell Death Dis. 2024.

2. A positive feedback between PDIA3P1 and OCT4 promotes the cancer stem cell properties of esophageal squamous cell carcinoma. Cell Communication and Signaling. 2024.