蛋白质间相互作用是其发挥功能的主要模式,蛋白质通过结合不同的伙伴来行驶不同功能,形成复杂的信号网络。免疫共沉淀(Co-IP)、pull down、荧光共定位等都是最常见的蛋白互作研究方法。
免疫共沉淀Co-IP:采用诱饵蛋白抗体或标签抗体(当诱饵蛋白融合特定标签时)调取体内结合的蛋白复合体,反应的是最真实的生理结合。合适的IP抗体是决定实验成功的关键。
pull down:在体外条件下研究蛋白间相互作用的方法,还可以确定蛋白间是否存在直接的相互作用。将目标蛋白与标签(GST或His等)在大肠杆菌中融合表达,借助标签的亲和介质纯化目标蛋白及其互作蛋白复合物,不受抗体限制。
荧光共定位:依靠荧光确定蛋白质具有相同定位,用于辅助证明而非直接证明细胞内蛋白间的相互作用。
这些方法相互补充,通过多种方法共同验证蛋白质间的相互作用,能更大程度的避免假阳性结果。
辉骏生物的合作伙伴——中山大学肿瘤中心华南肿瘤学国家重点实验室在Cancer Research(1区,IF=12.5)上发表的论文“A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma”,就同时采用了Co-IP和GST pull down方法,研究了糖原合成酶2(GYS2)在乙肝病毒相关性肝癌中的机制。下面我们来一起看一下这篇论文的研究思路。
1. 表达分析和细胞实验发现:GYS2在肝细胞癌(HCC)中显著下调,与糖原含量降低和患者不良预后有关;缺失GYS2极大地促进了肝癌细胞的生长。
2. RNA-seq发现:GYS2过表达导致p53蛋白上调,进而影响了p53的很多靶基因。
3. Co-IP、GST pull-down和功能恢复实验证实:GYS2与p53直接相互作用,并通过p53抑制肝癌生长。
4. 泛素化IP-WB实验发现:过表达GYS2减弱了p53蛋白的泛素化降解。
5. Co-IP、GST pull-down实验表明:GYS2与E3泛素连接酶MDM2竞争性结合来稳定p53。
6. 双荧光素酶、ChIP和乙酰化检测发现:p53蛋白又能与GYS2启动子结合,通过p300介导的乙酰化抑制GYS2转录活性,负反馈调节GYS2。
7. 表达检测发现:在HBx(HBV编码的关键致癌蛋白)阳性的肝癌病例中,GYS2低表达;与HBx互作的HDAC1(组蛋白去乙酰化酶)被敲低时,GYS2表达上调,说明HBx和HDAC1都会抑制GYS2的表达。
8. Co-IP、双荧光素酶和ChIP实验发现:HBx、HDAC和细胞核内乙酰化的p53形成复合体,共同调控GYS2启动子活性。
研究总结:
作者首先发现了GYS2在HCC中明显下调,并与糖原含量降低和不良患者预后相关。转录组测序结果表明GYS2低表达与p53通路有关,因此对它们展开了研究。体内体外实验证实了两者与HCC的关系。
为了展开机制研究,作者采用了多种蛋白-蛋白、蛋白-DNA相互作用的方法,描述了GYS2与E3泛素连接酶MDM2竞争结合p53蛋白,减弱其泛素化降解以维持其水平,此外,p53与HBx、HDAC1蛋白形成复合体,共同调控GYS2启动子活性,进而负反馈调节GYS2水平。由此可见,互作实验技术在分子机制研究方面具有重要的应用价值。
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