互作实验蛋白实验分子细胞实验

免疫共沉淀Co-IP实验操作问题答疑

Q1：免疫共沉淀Co-IP如果没有与目标蛋白质相互作用的蛋白质怎么办？或者，交互蛋白的信号太弱怎么办？

A1：可能是由于以下3种原因导致：

1. 裂解缓冲液中的去污剂浓度可能过高或过强。

降低洗涤剂的浓度，或将其改为温和的。通常，洗涤剂的强度顺序应为：

SDS>Trition>NP40>Digitonin>CHAPS

2. 靶蛋白在细胞中亚定位的影响。

改变裂解缓冲液的配方，使蛋白质释放。

3. 蛋白质-蛋白质相互作用太弱或不稳定。

将抗体更改为更亲和的抗体以捕获更多的靶蛋白。或者，应用表达系统来提高目标蛋白的纯度和浓度。其他，改变样品来源或优化样品处理，使样品具有更多的目标蛋白或相互作用蛋白。

Q2：假阳性太强或检测到的非特异性结合蛋白太多该如何操作？

A2：可能是以下2种原因：

1. 抗体浓度太高。

降低抗体浓度

2. 抗体特异性不够好。

将抗体更换为更好的抗体。如果非特异性结合仍然存在，将 NaCl 的浓度增加到低于 1M。

免疫共沉淀CoIP实验技术原理

细胞裂解后，孵育结合了抗体的珠子，诱饵蛋白通过其抗体结合到Beads上，同时诱饵蛋白的互作蛋白，也一起“共沉淀”到Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来，便得到免疫共沉淀CoIP产物。CoIP产物既可用Western Blot检测已知蛋白，也可用质谱鉴定未知蛋白。

当没有合适的诱饵蛋白抗体时，可以通过表达融合了Flag标签的诱饵蛋白，利用Flag标签做免疫沉淀。即细胞过表达Flag-Bait，经裂解后与anti-Flag珠子孵育，诱饵融合蛋白与Beads结合，其互作蛋白“共沉淀”到Beads上，再经洗涤、洗脱后用WB或质谱检测。

辉骏生物提供的Co-IP免疫共沉淀服务分为以下两种：

1. Co-IP WB，用于检测某样本中的诱饵蛋白和待测蛋白是否存在相互作用；

2. Co-IP MS，用于筛选某样本中的诱饵蛋白与哪些蛋白具有相互作用。

Co-IP（免疫共沉淀）检测服务
服务项目	服务内容	结果交付	实验周期	客户提供	价格
Co-IP WB	Western blot检测样本（input）中的诱饵蛋白和待测蛋白	Western blot检测图	4-5周	1、实验样本 2、诱饵蛋白的IP级抗体 3、待测蛋白抗体 4、实验信息表（样本信息、抗体信息、诱饵蛋白和待测蛋白序列）	点击询价
	Co-IP调取诱饵蛋白及其互作蛋白（2组：实验组、对照组）	CoIP实验报告
	Western blot检测Co-IP产物中的诱饵蛋白和待测蛋白	Western blot检测图
Co-IP MS	Western blot检测样本（input）中的诱饵蛋白	Western blot检测图	7-8周	1、实验样本 2、诱饵蛋白的IP级抗体 3、实验信息表（样本信息、抗体信息、诱饵蛋白序列）	点击询价
	Co-IP调取诱饵蛋白及其互作蛋白（2组：实验组、对照组）	CoIP实验服务报告
	Western blot检测Co-IP产物中的诱饵蛋白	Western blot检测图
	LC-MS/MS定性检测Co-IP产物的蛋白、筛选实验组独有蛋白（潜在互作蛋白）	质谱检索表格、互作蛋白筛选表格、检测报告
	针对互作蛋白做生物信息学分析（GO、KEGG pathway、String）	生物信息学分析结果和报告	1周