中文标题：Lnc-GD2H促进成肌细胞增殖和分化的机制研究

发表期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology

中科院分区：2区

影响因子：6.684

发表时间：2021年8月

合作单位：广东省第二中医院

运用技术：ChIP qPCR、RIP-qPCR、RNA  pull down MS、DNA pull down、双荧光素酶实验

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● 研究背景

成肌细胞决定蛋白（MyoD）、肌源性因子5（Myf5）、肌生成素（Myog）和肌特异性调节因子4（MRF4）等肌源性调节因子（MRFs）主要调节成肌细胞的增殖、分化和融合。除此之外，非肌肉特异性转录因子也参与肌肉再生，例如NACA可以与Myog启动子结合，抑制Myog转录和成肌细胞分化；c-Myc可以通过miRNA和长非编码RNA（lncRNA）的转录来调节成肌细胞的增殖和分化。研究团队之前已经发现一种lncRNA Gm13398在小鼠C2C12成肌细胞增殖和分化过程中高表达，并在成肌细胞分化过程中与Myog共表达。本研究将Gm13398命名为lnc-GD2H，探讨了其在成肌细胞的增殖和分化中的作用。

● 研究结果

1. Lnc-GD2H在成肌细胞增殖和分化中的表达模式及RNA-FISH定位

qPCR检测了lnc-GD2H、c-Myc和Myog在C2C12成肌细胞增殖和分化过程中的表达模式。图1A为成肌细胞形态，lnc-GD2H的水平随增殖和分化过程而逐渐增加（图1B）。c-Myc在增殖过程中上调，但在分化后下调（图1C）。Myog在分化过程中显著上调（图1D）。这些结果表明lnc-GD2H可能是一种参与细胞增殖和分化的肌源性因子。RNA FISH显示，在成肌细胞增殖和分化过程中，lnc-GD2H分布在细胞质和细胞核（图1E）。

  图1

2. Lnc-GD2H促进成肌细胞增殖，并促进该过程中的c-Myc表达                                                              

接着，研究人员构建了lnc-GD2H过表达的C2C12成肌细胞稳转株（图2A），并通过不同实验确定了lnc-GD2H在成肌细胞增殖中的潜在功能。qPCR和WB结果表明lnc-GD2H过表达导致c-Myc、CDK2、CDK4和CDK6这些增殖标志物的mRNA和蛋白水平升高（图2B、C）。lnc-GD2H过表达细胞中的EdU阳性细胞百分比显著高于对照（图2D，E）。CCK-8和细胞划痕实验证实lnc-GD2H过表达使成肌细胞有更高的存活率，促进了其增殖和迁移潜力。相反，lnc-GD2H干扰（图3A）抑制了C2C12细胞的增殖，c-Myc、CDK2、CDK4和CDK6 mRNA（图3B）和蛋白质（图3C）水平降低，EdU阳性细胞百分比降低（图3D，E），细胞存活率降低（图3F）。细胞划痕12和24小时，lnc-GD2H干扰细胞中的伤口大小显著大于对照细胞（图3G，h）。这些结果表明，lnc-GD2H对C2C12成肌细胞增殖有至关重要，并可能促进c-Myc的表达。

图2

图3

3. c-Myc在成肌细胞增殖过程中调节Lnc-GD2H的转录

那么，转录因子c-Myc是否也会影响Lnc-GD2H水平呢？研究人员同时构建了c-Myc过表达和干扰的C2C12稳转细胞株（图4A-B，D-E），c-Myc过表达或干扰分别促进和抑制了lnc-GD2H的水平（图4C-F）。双荧光素酶实验证实c-Myc增强了lnc-GD2H启动子的活性（图4G，H）；DNA pull down WB实验再次确定了lnc-GD2H启动子和c-Myc蛋白的结合（图4I）。之后，截短启动子的双荧光素酶实验发现结合位点存在于lnc-GD2H启动子中−1400至−2000的位置（图4J），研究者预测了c-Myc转录因子的三个结合位点（图4K）并同时突变它们，发现c-Myc不再促进lnc-GD2H启动子的活性（图4L），表明c-Myc可以与lnc-GD2H启动子上的这些位点结合。

图4

4. Lnc-GD2H在成肌细胞分化过程中促进细胞分化

C2C12分化过程中的lnc-GD2H表达增加，提示lnc-GD2H也可能在成肌细胞分化过程中发挥作用。进一步的实验结果显示：lnc-GD2H过表达后，MyHC蛋白（一种终末分化标志物）的免疫荧光增强（图5A），MyHC蛋白WB条带也显著高于对照（图5C），成肌细胞的融合指数更高（图5B），肌源性标志物基因Myog、Mef2a和Mef2c的表达增加（图5D，E），这些结果表明了C2C12分化的显著加速。相反，lnc-GD2H干扰抑制了C2C12成肌细胞分化，表现为：MyHC免疫染色和蛋白水平降低（图5F，H），融合指数降低（图5G），Myog、Mef2a和Mef2c的表达减弱（图5I，J）。

图5

5. Lnc-GD2H与NACA蛋白相互作用

为了研究lnc-GD2H的相互作用蛋白，他们采用生物素RNA pull down MS实验，调取并鉴定了lnc-GD2H的互作蛋白（图6A），惊喜的发现了参与细胞发育过程的关键转录因子NACA（图6B，C）。在线数据库RPISeq的分析结果也表明lnc-GD2H很可能与NACA结合（图6D）。为了验证它们之间的相互作用，研究人员用C2C12细胞提取物进行了RIP qPCR检测（图6E，F），结果显示，与IgG对照相比，NACA抗体的pull down富集了更多的lnc-GD2H（图6F），证实了lnc-GD2H与NACA蛋白的相互作用。

图6

6. Lnc-GD2H降低了Myog启动子中的NACA蛋白富集

基于以前的报道，研究者预测发现Myog基因的启动子区域存在NACA蛋白的两个潜在结合位点，因此他们做了野生和突变Myog启动子的双荧光素酶实验，结果显示NACA显著降低了野生Myog启动子的活性（图7A），但不能降低突变Myog启动子的活性（图7B），表明这两个预测位点可能是NACA的结合位点。此外，NACA干扰增强了Myog的mRNA（图7C）和蛋白质水平（图7D）。lnc-GD2H的过表达逆转了NACA过表达引起的Myog启动子双荧光素酶活性下降（图7E）。此外，ChIP-PCR显示，lnc-GD2H过表达显著干扰了NACA在Myog启动子区的富集（图7F）。这些发现表明lnc-GD2H可以与转录因子NACA结合来减轻NACA对Myog的抑制作用，改善Myog的转录以促进成肌细胞分化。

图7

7. Lnc-GD2H促进肌肉的损伤修复和再生

以上研究结果强调了lnc-GD2H在成肌细胞增殖和分化中的作用，提示lnc-GD2H可能对肌肉再生有影响。接下来，研究者给小鼠注射CTX来诱导损伤，并在注射CTX的前一天（-1）、注射后的第1天和第4天分别注射三次silnc-GD2H和siNC（图8A），来观察lnc-GD2H对体内肌肉再生的影响。H&E染色显示，在CTX损伤后的第3天和第6天， silnc-GD2H注射肌肉的再生肌纤维明显小于siNC注射肌肉（图8B），并且在损伤第6天的平均CSA也较小（图8C）。在损伤第3天，注射silnc-GD2H导致lnc-GD2H显著下调（图8D），c-Myc和Myog的mRNA（图8D）和蛋白质（图8E）水平也显著降低。损伤第6天也有类似的结果（图8F、G），这些结果表明lnc-GD2H可能促进肌肉损伤的修复和肌肉再生。

图8

● 研究结论

本研究发现lnc-GD2H对C2C12成肌细胞的增殖和分化有显著贡献。lnc-GD2H通过与c-Myc形成反馈环来促进增殖，并通过与NACA相互作用来上调Myog从而增强分化。这些结果为lncRNA参与肌肉再生的调控提供了新的思路和治疗靶点。

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