中文标题：METTL3介导的LncRNA EN_42575 m6A修饰减轻了CPB2毒素诱导的IPEC-J2细胞损伤

发表期刊：International Journal of Molecular Sciences

中科院分区：2区

影响因子：6.208

发表时间：2023年3月

合作单位：甘肃农业大学

运用技术：RNA pull down MS（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究背景

m6A修饰是真核生物中最丰富的RNA修饰，受多种酶类的调控，其中METTL3、METTL14和WTAP可形成复合体，是m6A甲基化酶的核心组分。C型产气荚膜梭菌侵袭性强，可感染家畜和人类，引起坏死性肠炎，产气荚膜梭菌β2 (CPB2)毒素是该菌的主要毒力因子。研究者之前已构建了C型产气荚膜菌仔猪腹泻体外细胞模型，并RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)实验发现lncRNA EN_42575的甲基化水平和表达水平因CPB2毒素处理而显著降低。本项目进一步阐述了lncRNA EN_42575的m6A修饰在该过程中的作用，为探讨仔猪感染性腹泻的表观遗传学观点提供了理论依据。

● 研究结果

1. LncRNA EN_42575的表达模式分析

为了评估CPB2毒素处理对lncRNA EN_42575表达的影响，研究者每12 h检测CPB2毒素培养的猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）中的LncRNA EN_42575表达，发现CPB2毒素处理可以显著降低lncRNA EN_42575的表达，处理24h达到最低值（图1A）。细胞核/质分离和RNA-FISH分析发现，lncRNA EN_42575定位于细胞质中（图1B,C）。这些结果表明lncRNA EN_42575在产气荚膜梭菌C型诱导的猪腹泻中起到了一定作用。

  图1

2. LncRNA EN_42575减轻CPB2诱导的细胞毒性，促进细胞增殖                                                                              

接着，研究者分别构建了过表达和干扰lncRNA EN_42575的IPEC-J2细胞株（图2A），用以分析lncRNA EN_42575在CPB2诱导的细胞毒性中的作用。细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性检测用于细胞损伤程度，结果显示CPB2处理引起LDH活性显著增加，而lncRNA EN_42575的表达水平与LDH活性成反相关，表明lncRNA EN _42575可以抑制细胞毒性（图2B）。CCK-8和EDU检测表明，CPB2处理显著降低了IPEC-J2细胞的活力和增殖能力，而lncRNA EN_42575过表达逆转了这一结果，lncRNA EN_42575干扰进一步抑制了细胞活力和增殖能力（图2C-E）。

图2

3. LncRNA EN_42575抑制CPB2诱导的细胞凋亡和氧化损伤

在细胞凋亡反应中，线粒体膜电位(ΔΨm)会降低，因此研究者用JC-1线粒体膜电位探针来检测LncRNA EN_42575对CPB2诱导的细胞凋亡的影响。CPB2毒素处理后，JC-1荧光从红色变为绿色，表明ΔΨm降低，凋亡增加。lncRNA EN_42575过表达导致绿色荧光减少，干扰后绿色荧光进一步增加（图3A）。lncRNA EN_42575过表达显著抑制了凋亡调节因子Bax的表达，促进了Bcl-2的表达，而lncRNA EN _42575干扰有相反趋势（图3B，C）。之后，研究者用荧光探针DCFHDA检测细胞中的活性氧（ROS），CPB2处理显著增加了绿色荧光，表明ROS水平升高，LncRNA EN_42575过表达降低了ROS水平，而干扰促进了ROS的升高（图3D）。这些结果说明lncRNA EN_42575可以抑制IPEC-J2细胞凋亡并减轻CPB2毒素诱导的氧化损伤。

图3

4. LncRNA EN_42575是METTL3的靶标

研究者使用Integrative Genomics Viewer软件对以往的MeRIP-seq项目数据进行了可视化分析，发现CPB2毒素处理导致两个高富集的特异性m6A峰消失了（图4A）。MeRIP-qPCR实验也证实CPB2处理显著降低了lncRNA EN_42575的m6A甲基化水平（图4B）。为了研究甲基化相关酶对lncRNA EN_42575的调控，分别过表达和敲低了METTL3（图4C），发现其水平与lncRNA EN_42575成正相关（图4D）。为了确定lncRNA EN_42575的m6A修饰对METTL3介导的基因调控的重要性，研究者构建了lncRNA EN_42575野生型和突变型(A到T)载体（图4E），并进行了双荧光素酶实验。结果显示，野生型METTL3显著增加了野生型lncRNA EN_42575的荧光素酶活性，不能增加突变型lncRNA EN_42575的荧光素酶活性；突变型METTL3与对照相比没有变化（图4F）。此外，在用放线菌素D阻断细胞RNA合成后，抑制METTL3的表达显著降低了lncRNA EN_42575的半衰期（t1/2）（图4G）。这些结果表明，METTL3通过m6A甲基化调控lncRNA EN_42575的表达。

图4

5. lncRNA EN_42575靶基因的功能分析

为了确定lncRNA EN_42575在CPB2诱导的IPEC-J2细胞中的功能。研究者采用RNA pull down MS技术来寻找能够与lncRNA EN_42575结合的蛋白质。对质谱（LC-MS/MS）鉴定到的70个潜在结合蛋白的GO功能和KEGG通路分析显示，它们参与了凋亡、沙门氏菌感染、癌症通路和冠状病毒病（新冠肺炎）等相关通路（图5B）。

图5

● 结论

本项目在前期MeRIP-seq实验的基础上，在仔猪感染性腹泻细胞模型中，进一步阐明了METTL3酶通过m6A甲基化调控lncRNA EN_42575的表达，进而抑制了CPB2诱导的细胞凋亡和氧化损伤，促进细胞增殖。

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