中文标题：Flot2是蛋白尿肾病中足细胞损伤的新调控因子

发表期刊：International Journal of Biological Sciences

中科院分区：2区

影响因子：10.750

发表时间：2023年1月

合作单位：广东省人民医院

运用技术：GST pull down MS（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究背景

足细胞损伤是慢性肾脏疾病(CKD)的常见标志。足细胞指状足突相互交织形成狭缝隔膜(SD)，是肾小球滤过屏障最重要的组成部分。这一过滤屏障的完整性对于防止蛋白质进入尿液(蛋白尿)非常重要。越来越多的致病SD蛋白已被发现，包括nephrin、podocin和CD2AP等。

本研究证实Flotillin-2（Flot2）在足细胞中特异性表达，对募集SD蛋白podocin和nephrin进入脂筏、改善足细胞损伤有至关重要的作用。Flot2和podocin通过SPFH结构域直接相互作用，此外转录因子KLF15可以调控Flot2的表达。在LPS/ADR诱导肾病小鼠模型中，足细胞特异性Flot2的缺失会加重蛋白尿、足细胞损伤和肾小球病变。此外，足细胞病变患者的肾活检中Flot2表达下调，其表达与蛋白尿负相关，与eGFR正相关，表明Flot2可能是蛋白尿肾病的新治疗靶点。

● 研究结果

1. Flot2在体内外受损足细胞中表达下调

Flot2是一种广泛表达且高度保守的疏水性脂筏蛋白。研究者对蛋白尿肾小球疾病患者的肾活检样本进行免疫荧光染色，发现Fot2在患者足细胞中的表达水平显著下降（图1A）。在糖尿病db/db小鼠（图1B），脂多糖（LPS）或阿霉素（ADR）诱导的肾病小鼠（图1C）中，肾脏中Flot2的表达也降低。在体外，高糖（HG）或LPS能显著降低足细胞Flot2的表达（图1D-F）。这些结果表明，Flot2在体内和体外损伤的足细胞中表达下调。

  图1

2. 足细胞特异性Flot2的缺失加重了LPS和ADR诱导的肾病小鼠的蛋白尿和肾损伤

研究者首先利用Cre-LoxP重组系统建立了足细胞特异性flot2敲除小鼠（图2A-E），之后用LPS和ADR诱导建立蛋白尿小鼠模型，进而评估了Flot2表达减少对蛋白尿和肾损伤的影响（图2F）。LPS注射后24h，小鼠尿蛋白水平升高，其中flot2敲除小鼠的尿蛋白水平显著高于未敲除组（图3A）。同样，ADR注射后约2周时，小鼠尿蛋白开始随时间延长而逐渐增加，并且flot2敲除小鼠的增加更多（图3B），PAS染色显示系膜扩张也增加更多（图3C-D）。透射电镜显示，用LPS或ADR处理的Flot2敲除小鼠的足细胞足突消失更多，足突宽度显著增加（图3E-F）。这些结果表明，敲除Flot2的足细胞增加了对LPS和ADR的易感性和肾损伤。

图2

图3

3. 足细胞特异性Flot2过表达改善LPS和ADR诱导的小鼠蛋白尿和肾损伤

接着，研究者又构建了足细胞特异性flot2过表达C57BL/6小鼠，并通过腹腔注射LPS或尾静脉注射ADR建立足细胞损伤和蛋白尿小鼠模型，研究了Flot2在体内对足细胞的保护作用（图4）。LPS注射24h后或ADR注射4-12周，flot2过表达组小鼠的尿蛋白增加量显著少于对照组（图5A-B）。此外，ADR处理的flot2过表达组小鼠的系膜基质扩张减弱（图5C-D）。透射电镜观察发现LPS处理导致小鼠足细胞足突融合，Flot2过表达改善了这种变化（图5E-F）；注射ADR12周后，Flot2过表达小鼠的足突消失和足突宽度相比对照组明显改善（图5E-F）。这些数据表明足细胞特异性Flot2的过表达对LPS和ADR诱导的损伤有保护作用。

图4

图5

4. 体外实验表明足细胞Flot2调控肌动蛋白细胞骨架的排列

由于细胞骨架重组在足细胞损伤和蛋白尿中起着重要作用，因此研究者使用体外足细胞模型探讨了Flot2对足细胞骨架结构的影响。Flot2敲低导致肌动蛋白丝重组和细胞质径向应力纤维溶解(图6A-D)，并刺激细胞收缩，使细胞变小。在腺病毒介导的Flot2过表达足细胞中（图6E-G），肌动蛋白重排和细胞收缩被消除（图6H），说明Flot2导致足细胞肌动蛋白细胞骨架重排。

图6

5. 脂筏中SD蛋白的定位需要Flot2

SD蛋白调节足细胞骨架动力学、蛋白表达和细胞存活，因此研究者通过干扰和过表达足细胞中的Flot2来观察SD蛋白在脂筏中的定位。结果显示，干扰Flot2显著降低了SD蛋白podocin和nephrin在脂筏中的质膜分布（图7A），在LPS处理的足细胞中也观察到类似结果。相反，过表达Flot2促进了podocin和nephrin在脂筏中的表达（图7B）。之后，CTxB标记也观察到Flot2干扰降低了podocin在脂筏中的分布，LPS和ADR处理的足细胞有类似结果（图7C），过表达Flot2恢复了脂筏中podocin的表达（图7D）。接着，他们研究了足细胞特异性Flot2缺失小鼠在LPS处理下的podocin和nephrin分布，发现Flot2缺失导致LPS处理后小鼠脂筏中podocin和nephrin的减少加剧（图7E）。体外结果表明Flot2可能有助于SD蛋白定位到脂筏中。

图7

6. Flot2通过SPFH结构域直接与足蛋白相互作用

通过双标记免疫荧光共聚焦显微镜发现，podocin和Flot2在人类和C57BL小鼠足细胞中有部分重叠（图8A-B）。使用免疫沉淀（Co-IP）检测到它们在足细胞中有相互作用（图8C），通过GST-pull down和His-pull down检测确定了Flot2和podocin之间有直接相互作用（图8D）。之后，研究者构建了5个截短的Flot2载体和6个截短的podocin载体（图8E-F），足细胞CoIP实验进一步确定了Flot2的30-184氨基酸与podocin相互作用（图8G），Flot2与podocin的128-284氨基酸相互作用（图8H）。HEK-293T细胞的免疫共沉淀和GST pull down实验也确定了Flot2蛋白的氨基酸30-184与podocin蛋白的128-284氨基酸具有相互作用（图8I-J）。

图8

7. 转录因子KLF15介导了Flot2的转录

转录因子预测分析显示，Krüppel样转录因子（KLFs）可能参与了对Flot2的转录调控。以往研究显示KLF4、KLF6和KLF15在肾小球足细胞中表达，且在蛋白尿肾小球疾病的受损足细胞中表达较低。因此，本研究首先在HG、LPS或ADR诱导的小鼠足细胞中确定了它们的表达水平，结果与之前研究一致（图9A）。此外，当干扰KLF6或KLF15后，足细胞中的Flot2 mRNA显著降低（图9B-D），干扰KLF15后Flot2蛋白表达也显著降低（图9E-F）。足细胞KLF15过表达后，Flot2的mRNA和蛋白水平显著增加（图9G-I），表明KLF15是Flot2表达的关键调节因子。ChIP-qPCR结果表明KLF15与Flot2启动子结合（图9J），并且LPS处理后，小鼠足细胞中KLF15与Flot2启动子的结合显著减少（图9K）。双荧光素酶报告基因测定发现，干扰KLF15导致Flot2转录活性显著降低，而过表达KLF15则升高（图9L），表明KLF15直接调节Flot2基因启动子活性。

图9

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