中文标题：口腔鳞状细胞癌中ENO1与ApoC3结合并通过IL-8/STAT3通路抑制T细胞增殖

发表期刊：International Journal of Molecular Sciences

中科院分区：2区

影响因子：6.208

发表时间：2022年10月

合作单位：武汉大学

运用技术：GST pull down MS（由辉骏生物提供技术支持，点击查看服务详情）

● 研究概述

口腔鳞状细胞癌（OSCC）的淋巴结转移与预后不良有关，但很少有研究探讨术后淋巴引流（PLD）与转移性OSCC的相关性。α-烯醇化酶（ENO1）是一种代谢酶，与OSCC淋巴转移有关，但是其作用机制尚未阐明。本研究收集了OSCC患者转移和非转移淋巴结切除术后的淋巴引流液，研究了ENO1表达与转移的关系，并通过GST pull down MS实验找到了与ENO1相互作用的蛋白——载脂蛋白C-III (ApoC3)；它们的结合导致了白细胞介素(IL)-8的产生，进而激活了Jurkat T细胞的STAT3信号通路，促进细胞凋亡，抑制Jurkat T细胞增殖。总之，这些发现阐明了ENO1在转移性OSCC中功能的分子机制，并为靶向ENO1治疗OSCC提供了新的策略。

● 研究结果

1. ENO1在人OSCC组织中高表达且与临床病理有相关性

IHC检测发现，ENO1在人口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的表达水平比正常口腔粘膜（NOM）（p<0.001）（图1A）和口腔上皮发育不良（OED）（p<0.05，图1B）中的更高。进一步研究表明，ENO1与OSCC T分期之间没有明显的相关性（p>0.05，图1C，D），但有淋巴结转移的患者中的ENO1表达高于无淋巴结转移患者（p<0.05，图1E），ENO1在转移性淋巴结中的IHC染色也比非转移性淋巴结的更强（p<0.05，图1F，G）。ELISA结果显示，转移性OSCC患者PLD中的ENO1水平高于非转移性OSCC患者（p<0.01，图2A）。这些结果表明ENO1的高表达与淋巴结转移状态呈正相关。

图1

2. OSCC中的ENO1与ApoC3相互作用

为了研究ENO1在OSCC淋巴转移中的作用机制，研究人员使用GST pull down方法捕获了ENO1在转移性OSCC患者PLD中的结合蛋白（图2B，C），并利用质谱（LC-MS/MS）技术对这些结合蛋白进行鉴定，结果显示有100个蛋白在OSCC PLD中显著富集，KEGG pathway对这些蛋白进行了分析（图2D）。对炎症发展至关重要的ApoC3蛋白被挑选用于后续验证，人OSCC细胞系CAL27和OSCC组织的双标记免疫荧光结果显示ApoC3和ENO1在CAL27细胞和OSCC组织中共定位。

图2

3. ApoC3在OSCC组织中高表达

流式细胞术对OSCC细胞系CAL27和人的永生化口腔上皮细胞系HIOEC中膜ApoC3的检测显示，ApoC3在CAL27细胞中的表达更高（图3A，B，p<0.001）。在激光共聚焦显微镜下，ApoC3在CAL27细胞的细胞膜上高度表达，但在HIOEC细胞中少量表达（图3C）。用IHC染色显示ApoC3的表达显著高于NOM（p<0.05，图3D，E）。此外，ApoC3在转移淋巴结中的表达显著高于非转移淋巴结（p<0.01，图3F，G），ApoC3的表达与淋巴结转移呈正相关。聚类分析发现ENO1和ApoC3之间的表达趋势相似（图3H），Pearson相关分析说明两者之间的相关性（p=0.0479，r=0.2966，图3I）。

图3

4. ENO1与ApoC3结合介导促炎细胞因子的产生

设计三种靶向ENO1（ENO1siRNA-1/2/3）干扰的siRNA，干扰效率检测确定了ENO1siRNA-2的效果最好（图4A）。通过QAH-INF-1细胞因子抗体阵列测试ENO1与ApoC3结合对CAL27细胞炎性细胞因子产生的影响（图4B）。结果表明， ApoC3刺激导致CAL27细胞产生的IL-8增加；当ENO1下调时，CAL27细胞产生的IL-8受到抑制（图4C），ELISA结果与细胞因子抗体阵列结果一致（图4D）。ELISA结果显示，对照组和ENO1干扰组的IL-8产生水平没有显著差异，而在用人重组ApoC3蛋白刺激后，这两组差异显著，IL-8的产生显著降低（p<0.01）。

图4

5. IL-8通过STAT3信号通路抑制T细胞增殖

流式细胞检测显示，不同浓度重组IL-8蛋白处理后，Jurkat T细胞的凋亡率随IL-8浓度的升高而增加（图5A），当IL-8为0.8µg/mL时，凋亡率最高（p<0.001，图5B），且IL-8对Jurkat T细胞的Ki67表达具有抑制作用（p<0.001，图5C，D）。CCK-8结果显示，细胞增殖随IL-8浓度的增加而受到抑制（图5E）。为了研究IL-8调控Jurkat T细胞的潜在机制，Western blot和流式细胞术检测了p-STAT3的表达。通过与CAL27细胞共培养，Jurkat T细胞中的p-STAT3水平升高，但经过IL-8中和抗体处理后，p-STAT3的水平下降(图5F,G)。此外，IL-8受体CXCR1/2的抑制剂reparixin不同程度的降低了p-STAT3的水平（p<0.05，图5H，I）。用重组IL-8蛋白刺激后，Jurkat T细胞中的p-STAT3水平增加（p<0.001，图5J，K）。在用下降后，STAT3抑制剂恢复了IL-8处理对Ki67水平的抑制（p<0.01，图5L，M）。这些结果表明，STAT3在IL-8对Jurkat T细胞的调节过程中起重要作用，IL-8促进STAT3的磷酸化并损害Jurkat T细胞的增殖。

图5

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