中文标题：人膀胱癌中的MIR516A通过降低PHLPP2表达和BECN1依赖性自噬发挥致癌作用

发表期刊：Autophagy

中科院分区：1区

影响因子：16.016

发表时间：2021年1月

合作单位：温州医科大学

运用技术：LC-MS/MS蛋白质谱鉴定（由辉骏生物提供技术支持，点击查看详情）

● 研究背景

根据以往报道，MIR516A在卵巢癌、肺癌、原发性胃癌和前列腺癌等多种癌症中下调，并起到肿瘤抑制作用。但MIR516A和PHLPP2在人类膀胱癌（BC）中的表达情况和潜在作用仍有待研究。

● 研究结果

1. MIR516A促进体内和体外的BC细胞生长

qPCR检测了MIR516A在新鲜临床BC组织样本和人BC细胞系（TCCSUP、UMUC3、J82和RT112）中的表达，发现MIR516A在BC样本中的表达出乎意料的显著高于对照（图1A，B），这一结果与TCGA 数据库中19对膀胱癌组织的检测结果一致。体外建立的MIR516A干扰（MIR516Ai）稳转株（BC细胞系：UMUC3和J82）和软琼脂实验结果也表明抑制MIR516A可以显著降低BC细胞的单层生长（图1C-E），也会损害其锚定依赖性生长（图1F，G）。

这些结果表明，MIR516A不仅在人BC组织中过表达，而且起致癌作用。在体内异种移植裸鼠模型中，注射MIR516A抑制剂减弱了裸鼠BC细胞的异种移植瘤生长（图1H，I），表明MIR516A促进体内膀胱肿瘤生长。

图1

2. MIR516A靶向PHLPP2并下调其在人BC细胞中的蛋白水平

TargetScan工具预测了MIR516A的可能靶基因ACTG2、ETS2和PHLPP2（图2A），进而在干扰MIR516A的BC细胞中后检测了三者的蛋白水平，发现PHLPP2上调（图2B）。已知PHLPP2是一种良好的肿瘤抑制因子，因此选定其为研究目标。PHLPP2在BC细胞中的过表达显著抑制了细胞的锚定非依赖性生长（图2C，D）；双荧光素酶实验进一步确定了MIR516A对PHLPP2 mRNA 3’UTR的调控（图2E，F）；qPCR实验表明MIR516A不影响PHLPP2 mRNA水平（图2G）（图2G），预测MIR516A可能通过抑制其蛋白翻译而下调PHLPP2。

那么， MIR516A是否通过PHLPP2影响BC细胞的锚定依赖性生长？在MIR516Ai细胞中继续敲低PHLPP2，这增加了细胞的锚定非依赖性生长（图2H，I），表明MIR516A诱导的PHLPP2下调在MIR516A促进BC细胞生长中起作用。

图2

3. 抑制MIR516A可诱导BC细胞自噬并抑制锚定非依赖性生长

为了研究MIR516A对BC的调节机制，研究者在体外BC细胞（UMUC3和J82）中干扰MIR516A（MIR516Ai），自噬标记物LC3从LC3-I到LC3-II的转变（图3A）、LC3点状聚集物（图3B-D）和自溶酶体的形成（图3E，F）表明MIR516A诱导了BC细胞自噬；而当MIR516Ai细胞继续敲除PHLPP2后，这些自噬现象都受到抑制（图3G-J）。

抑制MIR516A可诱导自噬，所以是自噬导致BC细胞生长抑制的吗？研究者采用自噬抑制剂BAF处理MIR516Ai细胞，这导致LC3-II水平的显著累积（图3K），并逆转了MIR516Ai对细胞锚定非依赖性生长的抑制（图3L，M），表明MIR516A抑制人BC细胞中的自噬，进而促进BC细胞生长。

图3

4. FBXW7-185aa对胶质瘤细胞的作用及其分子机制

MIR516A是否对自噬相关蛋白质(ATGs)的表达有影响呢？对MIR516Ai细胞中这些蛋白的检测发现，只有BECN1（启动自噬的关键蛋白）上调了（图4A，B，再继续敲低PHLPP2后，BECN1表达均减弱了（图4C），表明BECN1被MIR516A抑制，并可能在MIR516A引起的自噬抑制通路中起作用。接着，他们在同时干扰MIR516A和PHLPP2的BC细胞中过表达BECN1，发现LC3-II转化显著增加（图4D），细胞锚定非依赖性生长显著被抑制（图4E，F）。敲低MIR516Ai细胞中的内源性BECN1（图4G）降低了LC3-II转化、点状聚集物形成和自溶酶体形成（图4H-J），也挽救了MIR516Ai细胞的锚定非依赖性生长（图4K，L）。这些结果表明，抑制MIR516A导致BECN1上调，进而诱导BC细胞自噬，且抑制其锚定非依赖性生长。

图4

5. MIR516A-PHLPP2通路促进了cul4a介导的BECN1蛋白降解

在同时干扰MIR516A和PHLPP2的BC细胞中检测BECN1 mRNA和蛋白水平，发现其mRNA没有变化（图5A），但是蛋白降解速率增加（图5B-D）。此外，MIR516Ai显著降低了BECN1蛋白的降解速率。之后，作者采用共免疫沉淀（co-IP）和质谱鉴定（LC-MS/MS）方法筛选了BECN1的互作蛋白，发现BECN1的互作蛋白中没有PHLPP2，但却包括E3泛素蛋白连接酶的几个核心成分CUL3、CUL4A和CUL4B，并显示出更高的肽谱匹配数（图5E）。据报道，CUL3和CUL4可以通过泛素化介导的蛋白酶体调节BECN1蛋白的稳定性和降解。因此作者检测了MIR516A和PHLPP2对这些蛋白表达的影响，发现只有CUL4A蛋白水平有变化（图5F）。Co-IP实验证实CUL4A和BECN1具有相互作用（图5G）。CUL4A过表达和干扰实验显示，CUL4A促进BECN1蛋白降解。这些结果表明，MIR516A-PHLPP2依赖CUL4A促进BECN1蛋白降解。

图5

6. 体内实验表明MIR516Ai上调PHLPP2和BECN1，同时下调MKI6

体内异种移植瘤免疫组化（IHC）实验显示，MIR516Ai导致PHLPP2与BECN1表达上调、MKI67（癌细胞增殖标志物）阳性BC细胞持续减少（图6A-D），并且PHLPP2表达与BECN1表达呈正相关（r=0.8235，p=0.0013）（图6E）。

总之，这些结果表明，MIR516A抑制通过结合PHLPP2 mRNA的3′UTR上调PHLPP2，导致CUL4A介导的BECN1蛋白降解减少，并进一步增加BECN1介导的自噬，从而抑制BC生长（图6F）。

图6

● 研究结论

本研究发现MIR516A在人类膀胱癌（BC）中的作用与在已往报道的抑癌作用相反，它并非作为BC抑制因子，而是一种促进因子。MIR516A在BC组织和细胞系中显著上调，抑制了其靶基因PHLPP2的表达，进而部分促进CUL4A介导的BECN1蛋白降解，减少了BC细胞自噬并促进BC生长。这是首次发现MIR516A在其他癌症中未被发现的独特功能。

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