人工环状 RNA 可绕过细胞抗病毒反应

发布时间：2022-05-11 09:50:10作者：辉骏生物-fitgene

研究人员在置换的内含子-外显子 (PIE) 系统中制造了人造环状核糖核酸 (circRNA) 海绵，并表明这些海绵不会激活先天免疫。

研究背景

天然存在的circRNA是自然界中丰富的一类非编码RNA，但其分子功能尚不清楚。当作为 microRNA (miRNA) 海绵发挥作用时，circRNA 调节和中和内源性 miRNA 水平。因此，研究者近年来对 circRNA 的研究对于医学和药物科学的发展变得越来越重要。

在他们之前的一项工作中，作者开发了一种体外生产和纯化人工 circRNA 海绵 (ciRS) 作为 miRNA 抑制新剂的方法。使用丙型肝炎病毒 (HCV) 模型，他们证明人工 ciRS 能够隔离成熟的 miRNA 以削弱其生物学功能。随后，他们证明了 ciRS 可以靶向 miR-21，这是最早发现的致癌 miRNA 之一。对小动物的研究表明，人工 ciRS 如何隔离 miR-21 以抑制肿瘤生长。

总体而言，ciRS 已成为一种新的药物，可抑制多种人类疾病中的 miRNA 活性，包括癌症和病毒感染。

甚至基于信使 mRNA 的 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 疫苗也使用体外转录的 RNA。因此，研究治疗性 circRNA 在全身递送时是否会触发宿主细胞中的抗病毒反应将是有趣的。值得注意的是，基于 mRNA 的 COVID-19 疫苗绕过了细胞免疫，从而获得了临床应用的成功。

关于研究

在本研究中，研究人员用线性和环状 miR-21 (liRS/ciRS-21-bu) 和对照 RNA (liRS/ciRS-21-rnd) 转染 A549 细胞，然后通过 RNA 测序进行转录组分析以鉴定免疫转染后激活的信号通路。

为了提高体外生产的 circRNA 的纯度，他们使用了聚丙烯酰胺凝胶纯化方法。在纯化过程中特定的聚丙烯酰胺浓度下，circRNA 在空间上与其他分子种类分离。他们还进行了差异基因表达分析 (DGEA) 以鉴定转染细胞中差异表达的 mRNA。

该团队还创建了一个广泛的双链 circRNA (ciRS-21-ds)，其基本结构与 ciRS-21-bu 和 ciRS-21-rnd 相同，但包含 50 个碱基对 (bp) 的随机自互补序列。最后，研究人员使用定量逆转录聚合酶链反应 (RT-qPCR) 评估了转染细胞中通过 RNA 测序鉴定的上调基因的 mRNA 水平。

研究结果

基因本体（GO）富集分析揭示了用 ciRS-21-bu 处理后几个基因的上调。其中，6个基因与先天免疫反应相关，包括趋化因子配体（CXCL）1、2、3和8，以及早期生长反应1（EGR1）、白细胞介素1受体相关激酶2（IRAK2）、和肿瘤坏死因子受体 (TNFR) 相关因子 1 (TRAF1)。

令人惊讶的是，ciRS-21-ds 还上调了蛋白激酶 R (PKR)，这是细胞免疫中的关键 RNA 传感器，因此表明序列组成和广泛的二级结构元件可能在抗病毒防御的诱导中发挥作用。此外，DGEA 数据显示转染 ciRS/liRS-21-bu 或 ciRS/liRS-21-rnd 的细胞的转录组非常相似。

ciRS-21-ds 在序列内显示出高度可信的碱基配对相互作用，最大长度为 50 bps，从而形成二级结构。然而，体外生产效率较低并对转录效率产生不利影响，并改变了聚丙烯酰胺-尿素凝胶内的流动性。

正如在 RT-qPCR 中观察到的，少量 ciRS-21-ds 足以增加与先天免疫信号相关的 mRNA 水平。然而，转染 ciRS-21-bu 的 A549 细胞需要更高剂量的 circRNA 才能将这些 mRNA 的上调降至最低。