标题：Circular RNA hsa-circ-0004872 inhibits gastric cancer progression via the miR-224/Smad4/ADAR1 successive regulatory circuit.

期刊：Molecular Cancer

影响因子：10.679

关键词：circRNA，miRNA，miR-224，hsa-circ-0004872，p21，Smad4，ADAR1，胃癌

主要技术方法：circRNA测序，RNA免疫共沉淀（RIP-qPCR），染色免疫共沉淀（ChIP-qPCR），双荧光素酶报告基因检测，细胞实验和小鼠实验等。

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，在癌症致死率方面排名第三，由于复发率高和转移，胃癌患者的预后很差。越来越多的研究表明，环状RNA(CircRNA)在癌症的发生和发展中起重要的调节作用，探索胃癌中circRNA的表达情况和作用机制将有助于寻找新的诊断标志物和治疗靶点，对提高胃癌患者的生存率至关重要。

2020年11月，山东大学基础医学院的研究人员发现在胃癌中显著下调的circRNA——hsa-circ-0004872，其表达水平与肿瘤大小和局部淋巴结转移有关。hsa-circ-0004872作为miR-224 的“分子海绵”来上调miR-224靶标p21和Smad4的表达，其本身受到RNA编辑酶ADAR1的抑制，miR-224靶标Smad4又可以结合ADAR1的启动子并抑制其表达，从而正反馈调控hsa_circ_0004872的水平。该发现可能为胃癌的诊断和治疗提供新的思路和靶点。

1.    胃癌中低表达的hsa-circ-0004872可以抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移
研究者采用circRNA测序分析了胃癌和癌旁组织中的差异表达circRNA，并在42对临床样本中做了qPCR验证，最终选择在胃癌组织中下调最显著的hsa-circ-0004872作为研究目标。Sanger测序、发散引物扩增实验确认了胃癌中hsa-circ-0004872的存在，进一步的临床样本分析表明，hsa-circ-0004872的表达水平与胃癌进程和肿瘤大小有关。RNase R处理、Northern blot检测和转录抑制剂ActD处理实验确定了hsa_circ_0004872具有比线性RNA更好的稳定性。EdU、CCK-8、伤口愈合和transwell等细胞实验表明，hsa_circ_0004872可以抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移，干扰hsa_circ_0004872后即有相反的效果。

2.    hsa-circ-0004872与miR-224相互作用
由于FISH检测发现hsa_circ_0004872定位于细胞质中，因此推测它可能作为“miRNA海绵”发挥作用。AGO2抗体的RNA免疫共沉淀（RIP）可以富集到hsa_circ_0004872，表明其通过AGO2与miRNAs结合。接下来，数据库预测了hsa_circ_0004872的潜在靶miRNAs，发现只有hsa-miR-224(miR-224)具有致癌功能。RNA pull-down和双荧光素酶报告基因实验均表明hsa_circ_0004872与miR-224相互作用。

3.    hsa-circ-0004872通过miR-224上调其靶标p21和Smad4的表达
过表达/干扰和细胞实验表明miR-224促进胃癌的细胞增殖、侵袭和迁移。为了确定miR-244在胃癌细胞中的靶基因，作者查找文献并进行了WB检测和双荧光素酶实验，确定了其中2个靶基因“p21”和“Smad4”。之后检测了hsa_circ_0004872对Smad4和p21表达的影响，发现hsa_circ_0004872的水平与胃癌细胞中的Smad4和p21蛋白水平呈正相关。功能回补实验表明，hsa_circ_0004872至少部分通过miR-224抑制GC的增殖、侵袭和迁移。

4.    hsa_circ_0004872抑制体内肿瘤生长和转移
hsa_circ_0004872过表达胃癌细胞和对照细胞通过皮下注射和尾静脉注射的方式导入小鼠体内，hsa_circ_0004872过表达组形成的肿瘤平均体积远小于对照组，HE染色显示所有肿瘤均为实体瘤，qRT-PCR分析表明，过表达组肿瘤中hsa_circ_0004872的水平高，而miR-224的水平低。IHC结果显示过表达组肿瘤中p21和Smad4的表达增加；此外，过表达组小鼠肺表面的转移结节明显小于且少于对照组。说明hsa_circ_0004872有效地抑制了体内肿瘤的生长和转移。

5.    hsa_circ_0004872受RNA编辑酶ADAR1调节
circRNA的形成受到核糖核酸结合蛋白的调控，通过查找基因表达数据库，发现只有RNA编辑酶ADAR1在胃癌组织中的表达显著高于非肿瘤组织，qPCR实验验证了这一结果。数据库分析表明，胃癌组织中ADAR1的高表达与生存期较短有关。ADAR1过表达/干扰实验确定了ADAR1蛋白对hsa_circ_0004872有抑制作用。功能回补实验表明，ADAR1干扰导致的miR-224下调被hsa_circ_0004872 siRNA部分逆转，表明ADAR1通过hsa_circ_0004872调节miR-224的表达。

6.    Smad4通过ADAR1调节hsa_circ_0004872水平
由于miR-224的靶基因Smad4是一种转录因子，因此研究了其是否可以反馈调节ADAR1的水平。预测结果显示，ADAR1启动子区域存在Smad4结合位点，ChIP实验确定了Smad4可以直接与ADAR1启动子区域结合。进一步的实验表明，Smad4过表达导致了ADAR1蛋白和mRNA水平显著下调，hsa_circ_0004872水平上调。双荧光素酶也再次证明了Smad4过表达降低了ADAR1的启动子活性。