近日，研究人员开发并表征了一种高度特异性的EpiEditing系统，该系统使用催化失活的Cas9（dCas9）来实现等位基因特异性脱氧核糖核酸（DNA）甲基化（ASM）。

表观基因组编辑涉及使用称为EpiEditor的工具对特定基因组区域进行精确重编程。EpiEditor通常由诸如dCas 9、DNMT 3A/3L和单向导核糖核酸（RNA）（sgRNA）的组分组成。通过将甲基化引入特定基因座，可以调节基因表达。

ASM具体指甲基化仅靶向递送至基因组基因座的一个等位基因。在由显性突变引起的疾病的情况下，选择性地甲基化突变等位基因可以用于抑制其表达，同时保留基因的功能。

在本研究中，通过用来自AIO-mCherry载体的sgRNA表达盒替换pMulti-sgRNA-LacZ-DsRed载体骨架的一部分来构建单个sgRNA表达载体。对于在前间区序列邻近基序（PAM）区域中具有单核苷酸多态性（SNP）的靶标，选择PAM上游的20个核苷酸（nt）的基因组序列作为sgRNA结合位点。相比之下，对于在sgRNA种子区中具有SNP的靶标，使用含有SNP的最近PAM上游的20 nt序列。

使用CRIP 0 R和CCTop评估所选择的sgRNA的效率和潜在的脱靶效应，使用QGRS Mapper分析sgRNA区域中的四链体DNA形成，而使用Golden Gate Assembly进行sgRNA表达载体的克隆。此外，用dCas 9 - 10 x SunTag、scFv-DNMT 3A/3L和多sgRNA表达载体的混合物进行HEK 293细胞的转染。

在每个质粒中包括荧光标记物以促进三阳性细胞的分选。提取基因组DNA，亚硫酸氢盐转化，并进行文库制备用于下一代测序（NGS）。此外，还使用Trim Galore！、PEAR、bwameth和MethylDackel。RNA分离和互补DNA（cDNA）合成之后，使用基因特异性引物进行表达分析，并使用两步聚合酶链反应（PCR）产生文库。确定外显子中具有SNP的基因的等位基因表达比率。

由于HEK 293细胞易于处理和高转染效率，因此选择HEK 293细胞用于本研究。为了收集基因组中SNP的数据，查阅了公共数据库。DNA甲基化水平的初始估计值从先前研究中产生的MBD 2-下拉测序数据获得。

进行计算机模拟搜索以鉴定位于基因启动子区的未甲基化CGI（CpG岛）中的SNP。基于潜在PAM位点附近或有希望的sgRNA的种子区域内的SNP的存在来过滤搜索结果。鉴定了具有合适SNP的十四个靶基因，其中设计了多达三个sgRNA以靶向每个基因等位基因。

基于SgRNA中SNP的位置（包括种子区、PAM序列的位置2或PAM位置3）对实验进行分类。PAM区域中导致鸟嘌呤（G）至Y变化的SNP是优选的，其中Y表示半胱氨酸（C）或牛磺酸（T），因为这些变化表现出scFv-DNMT 3A/3L-sfGFP、dCas 9 - 10 x SunTag-BFP和sgRNA-DsRed构建体进入HEK 293细胞的最佳区分。还使用在人类基因组中没有结合位点的乱序sgRNA进行对照实验。还测定了ASM对等位基因特异性基因表达比率的影响。选择在外显子中具有SNP的基因，并测定等位基因表达比率。

ASM导致ISG 15-Seed 2和MRPL 52-PAM 3基因的等位基因表达比率的显著变化。研究人员还对使用dCas 9开发和表征高度特异性的EpiEditing系统以实现ASM感兴趣。使用具有降低的非特异性活性的DNMT 3A/3L的改进版本作为催化部分，并通过SunTag系统连接到sgRNA/dCas 9复合物，用于信号放大和二聚化。

靶向sgRNA的种子区域或dCas 9的PAM区域内的杂合SNP以实现等位基因区分。靶向DNA甲基化的效率在靶标之间变化，其中大多数成功的靶标在选定的CpG位点处达到超过50%的平均DNA甲基化。

ASM的成功基于ASM的总体水平和在靶和脱靶等位基因处的DNA甲基化获得的比率来评估。最成功的ASM实验将SNP置于PAM区域中。脱靶等位基因的不需要的DNA甲基化可能由sgRNA/dCas 9复合物的脱靶结合或DNMT 3A/3L的靶向活性引起。

当前研究的研究人员在HEK 293细胞中使用sgRNA/dCas 9复合物成功实现了靶向等位基因特异性DNA甲基化。这种新方法与等位基因特异性甲基化的高特异性、效率和稳定性相关，所述等位基因特异性甲基化产生基因表达的等位基因比率的变化。

该研究结果证明了sgRNA/dCas 9复合物用于等位基因特异性表观基因组编辑的潜力及其在个性化医学中的适用性。

科研产品

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抗体工程服务

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