用于hPSC基因编辑的新方法产生高达84%的敲除效率

发布时间：2022-09-13 14:30:27作者：辉骏生物-fitgene

宾夕法尼亚州立大学领导的跨学科研究团队开发了提高 CRISPR-Cas9 效率的技术，该基因组编辑技术在 2020 年获得了诺贝尔奖。虽然 CRISPR-Cas9 比其他基因编辑更快、更便宜、更准确方法，根据宾夕法尼亚州立大学生物医学工程和生物学副教授、项目负责人Lian 的说法，该技术有局限性，特别是在改善人类健康的应用中。

研究人员开发了一种更有效、更容易获得的方法，将 CRISPR-Cas9 系统应用于人类多能干细胞 (hPSC)，该系统来源于联邦政府批准的干细胞系，Lian 表示，这可以极大地推进遗传疾病的诊断和治疗。该方法于 9 月 7 日发表在《Cell Reports Methods》上。

CRISPR-Cas9 代表成簇的定期间隔短回文重复和 CRISPR 相关蛋白 9，使科学家能够靶向遗传密码的精确位置以改变 DNA，从而提供创造新诊断工具和可能纠正突变以治疗遗传原因的机会的疾病。

CRISPR 使用称为质粒 DNA 的遗传物质盘来传递引导的核糖核酸 (RNA)，将 Cas9 酶定位在目标基因的精确位置。当 DNA 被定位时，Cas9 与其结合并将其切断，从而允许其他 DNA 修复切割。然后研究人员可以看到去除如何改变基因的表达。但 Lian 表示，目前基于 DNA 的 CRISPR 方法存在交付和编辑效率问题。

DNA CRISPR 效应器的交付率很低，当使用 CRISPR 时，只有 20% 到 30% 的目标细胞会接受基因编辑 DNA。将 RNA 递送到细胞中可以更有效；但是，当引入常规 RNA 时，细胞可以将其视为病毒。它们会破坏RNA 在它可以制造蛋白质之前，比如说，在几个小时内 - 并且这样做会破坏基因编辑的尝试。

为了改善结果，研究人员使用修饰的 RNA (modRNA) 改变了将基因组编辑工具传递给干细胞的方式。 modRNA 与质粒 DNA 的不同之处在于它用化学修饰的形式取代了 RNA 中发现的一种基础底物，并且通过更强的结构支持来稳定它。

发现 modRNA 比质粒 DNA 更有效，大约 90% 的细胞通过简单的转染获得了 modRNA，因此它能够保持原位并完成其工作。研究人员还发现，modRNA 存在的时间是理想的：足够长以修饰细胞，但又不会太长以至于导致脱靶活动。但据 Lian 说，modRNA 引入了另一个问题。

当 modRNA Cas9 成功传递到目标基因时，它会在基因组中产生双链断裂，一些细胞会尝试修复它。那些自我修复的人可以将修复或“突变”传递给他们的后代。这是研究人员想要更好地理解的过程，因此这些是他们想要收获和研究的细胞。 Lian 说，问题在于大多数有这种断裂的细胞将其视为基因组的一个主要问题，并且会自我毁灭而不是试图自我修复。

为了减少 Cas9 的毒副作用并帮助编辑后的细胞存活，Lian 的团队引入了一种已知有助于细胞生长的小蛋白质。据 Lian 介绍，这种添加的蛋白质抑制了细胞死亡，并将 Cas9 编辑效率提高了 84%。

研究人员还发现，modRNA 可以改进其他基因编辑技术，例如碱基编辑。碱基编辑可以通过使用蛋白质改变单个核苷酸而不是像 CRISPR 那样切割两条链来敲除基因或纠正基因组中的突变。

“我们用基于质粒或基于 modRNA 的碱基编辑蛋白转染干细胞，”Lian 说。 “我们基于 modRNA 的方法在成功编辑基因组方面的效率是基于质粒的技术（大约 16%）的四倍多，达到 68%。”

Lian 表示，随着更多基因编辑实验室提高基因编辑效率和有效性，研究人员将能够更快地更好地了解基因及其功能。人体有 20,000 多个基因，但我们只研究了其中约 10% 的功能，一次一个地检查每个剩余基因的目的可能需要一生的时间。使用来自我们高效基因编辑技术的工程干细胞可以大大加快这一过程。

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