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(必看 !)低丰度蛋白质免疫沉淀的方法和技巧
蛋白质丰度对于免疫沉淀至关重要

免疫沉淀 (IP) 过程中,感兴趣的蛋白质 (POI) 被结合到珠子(如琼脂糖或磁性琼脂糖)上的特定抗体或纳米抗体拉下,通过洗涤去除未结合的样品内容物,例如其他蛋白质、细胞碎片和脂质,而沉淀的蛋白质在珠子上富集,对于成功的 IP,POI 的丰度或表达水平至关重要;  不幸的是,这经常被遗忘,如果 POI 表达强烈且丰富,那么 IP 很可能是直截了当的,没有任何困难。   但是,如果 POI 以低丰度或表达水平存在,则可能需要优化 IP 协议。


以下是辉骏生物介绍如何成功免疫沉淀低丰度 POI 的一些方法和技巧:

A. 使用具有高亲和力的抗体或纳米抗体

使用高亲和力、低解离常数 K D 纳米抗体可有效下拉少量 POI。 这是因为,根据稳态结合方程,当 POI 的浓度等于 K D 。 因此,理想情况下,POI 的浓度应超过用于 IP 的抗体/纳米抗体的 K D ,以结合尽可能多的 POI 并保持未结合 POI 的量尽可能低。 如果抗体的亲和力太低,解离常数太高,虽然 POI 存在于细胞裂解物中,但可能不会沉淀,这可能导致 IP 假阴性结果。


幸运的是,对于许多纳米抗体来说,高亲和力和高特异性齐头并进,确保细胞蛋白的低背景,这是低丰度蛋白 IP 的先决条件。


B. 增加 POI 的浓度

如果无法增加 POI 的丰度或表达水平,则可以使用以下提示和技巧增加其在测定中的浓度:

1. 使用更多细胞或组合几个细胞沉淀来制备细胞裂解物。

2. 不要向细胞裂解液中添加稀释缓冲液或仅添加少量缓冲液。

注意:仍然建议使用 500 µL 细胞裂解液和 25 µL GFP-Trap 浆液。

注意:可能需要更频繁和/或更剧烈的清洗,用 20-50 µL 2x SDS 样品缓冲液洗脱,并尝试在 SDS-PAGE/WB 上加载尽可能多的洗脱部分。

 

C. 放大WB中POI的信号

如果洗脱部分中的 POI 量非常低,即使 IP 成功,它也可能不足以进行 WB 检测。  在这种情况下,建议放大 POI 的 WB 信号。  当多克隆一抗与多克隆二抗组合用于 WB 检测时,可获得最高的信号放大。


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