蛋白质丰度对于免疫沉淀至关重要

在免疫沉淀 (IP) 过程中，感兴趣的蛋白质 (POI) 被结合到珠子（如琼脂糖或磁性琼脂糖）上的特定抗体或纳米抗体拉下，通过洗涤去除未结合的样品内容物，例如其他蛋白质、细胞碎片和脂质，而沉淀的蛋白质在珠子上富集，对于成功的 IP，POI 的丰度或表达水平至关重要；  不幸的是，这经常被遗忘，如果 POI 表达强烈且丰富，那么 IP 很可能是直截了当的，没有任何困难。   但是，如果 POI 以低丰度或表达水平存在，则可能需要优化 IP 协议。

以下是辉骏生物介绍如何成功免疫沉淀低丰度 POI 的一些方法和技巧：

A. 使用具有高亲和力的抗体或纳米抗体

使用高亲和力、低解离常数 K D 纳米抗体可有效下拉少量 POI。 这是因为，根据稳态结合方程，当 POI 的浓度等于 K D 。 因此，理想情况下，POI 的浓度应超过用于 IP 的抗体/纳米抗体的 K D ，以结合尽可能多的 POI 并保持未结合 POI 的量尽可能低。 如果抗体的亲和力太低，解离常数太高，虽然 POI 存在于细胞裂解物中，但可能不会沉淀，这可能导致 IP 假阴性结果。

幸运的是，对于许多纳米抗体来说，高亲和力和高特异性齐头并进，确保细胞蛋白的低背景，这是低丰度蛋白 IP 的先决条件。

B. 增加 POI 的浓度

如果无法增加 POI 的丰度或表达水平，则可以使用以下提示和技巧增加其在测定中的浓度：

1. 使用更多细胞或组合几个细胞沉淀来制备细胞裂解物。

2. 不要向细胞裂解液中添加稀释缓冲液或仅添加少量缓冲液。

注意：仍然建议使用 500 µL 细胞裂解液和 25 µL GFP-Trap 浆液。

注意：可能需要更频繁和/或更剧烈的清洗，用 20-50 µL 2x SDS 样品缓冲液洗脱，并尝试在 SDS-PAGE/WB 上加载尽可能多的洗脱部分。

C. 放大WB中POI的信号

如果洗脱部分中的 POI 量非常低，即使 IP 成功，它也可能不足以进行 WB 检测。  在这种情况下，建议放大 POI 的 WB 信号。  当多克隆一抗与多克隆二抗组合用于 WB 检测时，可获得最高的信号放大。

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