蛋白质磷酸化实验原理、主要类型和功能介绍

蛋白质磷酸化是指由蛋白激酶催化，将ATP或GTP的γ位磷酸基团转移到底物蛋白的氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等）上的过程。蛋白质磷酸化是体内常见的调节方式，在细胞信号转导过程中发挥着重要作用。几乎所有的蛋白质在合成过程中或合成后都会发生某种形式的修饰。异常的翻译后修饰与疾病的发生有关。某些特定的翻译后修饰被开发为疾病的分子标记或治疗靶点。最常见和最重要的蛋白质翻译后修饰，蛋白质磷酸化是将外部刺激转化为细胞内信号的主要机制。

在磷酸化反应中，在蛋白质的氨基酸侧链上加入一个带强负电荷的磷酸基团，引起酯化作用，从而改变其与其他分子相互作用的构型、活性和性能。酯化调节许多生物过程，例如信号转导、基因表达和细胞分裂。编码的蛋白质只会被特定的氨基酸磷酸化。在真核生物中，主要被丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等氨基酸残基磷酸化。在细菌中，残基如天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸磷酸化蛋白质。一些蛋白质在原核生物和真核生物中都被磷酸化，它们的磷酸化位点通常是精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸残基。可逆的蛋白质磷酸化调节细胞的大部分功能，如能量储存、形态变化、蛋白质合成、基因表达、信号因子释放、肌肉收缩和生化代谢。因此，蛋白质磷酸化分析和位点鉴定已成为蛋白质组学研究的重点之一。

蛋白质磷酸化的主要类型和功能

根据磷酸氨基酸残基的不同，磷酸化蛋白可分为4类：O-磷酸蛋白、N-磷酸蛋白、酰基磷酸蛋白和S-磷酸蛋白

1. O-磷酸蛋白是由羟基氨基酸（如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸）磷酸化形成的，但羟基脯氨酸或羟基赖氨酸的磷酸化作用尚不清楚。

2. N-磷酸蛋白由精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成。

3. 酰基磷酸蛋白由天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成。

4. S-磷酸蛋白由半胱氨酸磷酸化形成。

蛋白质磷酸化的功能是多种多样的

1. 参与其他重要的酶促反应（磷酸化反应产生中间产物，多为S或N磷酸盐等）

2. 介导蛋白质活性（蛋白质分子通过蛋白激酶的磷酸化改变性能），例如蛋白激酶 A（磷酸化丝氨酸和苏氨酸残基）或各种受体酪氨酸激酶（磷酸化酪氨酸残基）

3. 发挥多种独特的生理作用。例如，天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸磷酸化蛋白在细菌趋化反应的感觉传递中解离。某些激素也以特定磷酸化蛋白的形式存在于靶组织中。

蛋白质磷酸化的研究方法

近年来，更多的研究集中在蛋白质磷酸化上。一些主题包括确定蛋白质的位点特异性磷酸化、植物蛋白磷酸化和动物神经细胞磷酸化。新的研究方法不断涌现。最广泛使用的技术是质谱和同位素标记结合免疫印迹-化学发光分析。

质谱检测

质谱法是利用电场和磁场，根据质荷比检测带电运动粒子（包括原子、分子甚至分子结构片段）的物理和化学性质的方法。核素的精确质量是小数位数。任何两种核素的质量都是不同的，一种核素的质量并不完全是另一种核素的整数倍。因此，通过测量带电粒子（离子）的精确质量，可以确定相应的化合物组成、结构和裂化规律。

与未修饰的多肽相比，磷酸基修饰的多肽的相对分子质量增加了79.983。磷酸肽的产生意味着片段离子结构可用于诊断，这与未修饰的肽不同。质谱法可用于鉴定蛋白质磷酸化。通过使用特定序列水解酶（如胰蛋白酶）水解凝胶分离的蛋白质，获得不同的肽。高效液相色谱用于分离感兴趣的肽，然后进行质谱分析。

同位素标记结合免疫印迹-化学发光分析

该方法使用放射性同位素标记、二维电泳和放射自显影来建立蛋白质组图。通过免疫印迹持久化学发光可以选择性地识别和分析目标蛋白，也可以用于同时比较多个样品中相同蛋白的表达。

当蛋白质被磷酸化时，放射性 32 P的掺入和分子质量的变化会引起凝胶位移，这使得免疫印迹在分析检测中占有重要地位。

当化学反应产生的能量以光的形式释放出来时，称为化学发光。例如，最常用的化学发光试剂之一鲁米诺被过氧化物氧化产生氨基邻苯二甲酸酯。当该产物衰变为低能态时，会释放出一个光子。使用获得专利的添加剂来增加发光强度和发光反应的持续时间（稳定性），生产了一种增强的化学发光 (ECL) 试剂。在使用 ECL 的免疫印迹中，当酶和反应底物相互作用时，化学发光剂会产生可检测的光。特定抗体在适当稀释浓度下产生的稳定光信号输出有助于保持蛋白质检测的一致性和灵敏度。

磷酸化位点鉴定实验服务-辉骏生物

磷酸化是细胞信号通路中重要的共价翻译后修饰 (PTM)。这种修饰是一个可逆过程，由蛋白激酶催化。研究表明，超过 30% 的真核蛋白质会发生磷酸化。磷酸化修饰对靶蛋白主要有两种调控机制：（1）磷酸化可能引起修饰蛋白如酶、受体等结构的构象变化，从而“开启”或“关闭”功能。 (2) 磷酸化改变了蛋白质对其效应子的亲和力，通过这样做，磷酸化的蛋白质可以募集或释放其下游效应子。因此，可以想象磷酸化修饰调节广泛的生物活动，例如细胞生长、细胞代谢、细胞分裂等。

磷酸化可能发生在真核生物中的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和组氨酸残基上。在这四种类型的磷酸化中，酪氨酸磷酸化是最罕见的，但非常关键。最著名的酪氨酸激酶受体位于 MAPK 通路的最上游，调节 Ras 和其他激酶，启动磷酸化级联反应。

通过液质联用技术(LC-MS/MS)结合数据库检索，可以对目前已知的各种蛋白修饰类型（如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、琥珀酰化等）和一些小分子药物在蛋白上的修饰位点进行鉴定。