原则：      

在典型的染色质免疫沉淀 (ChIP)反应中，目标蛋白和 DNA 的交联是通过向生长的细胞中添加甲醛来进行的，染色质的制备、超声剪切和预清除以减少非特异性免疫沉淀。使用特异性抗体进行免疫沉淀。 从蛋白质 A 或蛋白质 G 琼脂糖树脂中洗脱蛋白质-DNA 复合物后，加热样品以逆转共价交联。 DNA 片段通过 PCR 或实时 PCR 进行纯化和分析。

缓冲器：      

细胞裂解缓冲液：

• • 0.1M Tris-HCl

• • 85mM 氯化钾

• • 0.5% NP-40

• • *1mM PMSF

• • *0.01mg/ml 抑肽酶

• • *0.01mg/ml 亮肽素

注意：标有 * 的成分应在每次使用前添加。

核裂解缓冲液：

• • 50mM Tris-HCl

• • 10mM EDTA

• • 1% SDS

• • *1mM PMSF

• • *0.01mg/ml 抑肽酶

• • *0.01mg/ml 亮肽素

注意：标有 * 的成分应在每次使用前添加。

透析缓冲液：

• • 2 mM EDTA

• • 50 mM Tris-Cl pH=8.0

• • 0.2 % Sarkosyl（仅用于多克隆抗体）

IP 洗涤缓冲液：

• • 100 mM Tris-Cl pH=9.0（单克隆抗体为 8.0）

• • 500 毫米氯化锂

• • 1% NP-40

• • 1% 脱氧胆酸

洗脱缓冲液

• • 50 mM NaHCO ₃

• • 1% SDS

协议：

第一天

1. 在细胞培养基中加入 37% 甲醛（原液）至终浓度为 1%，然后在旋转平台上在室温下缓慢摇动细胞 10 分钟。

2. 加入 100 μl 1.375 M 甘氨酸/ml 培养基淬灭交联

3. 加入甘氨酸至终浓度为 0.125M，停止交联反应，并在室温下继续振荡 5 分钟。

4. 适当去除培养基。 用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，然后用 PBS 将细胞刮入 15ml 锥形管中。 在 4°C 下以 2,000 rpm 离心 2 分钟。

5. 用 10 ml 细胞裂解缓冲液（冷）重悬沉淀并在冰上孵育 10 分钟。

6. 4°C 5,000 rpm 离心 5 分钟。 小心地用吸管丢弃上清液。

7. 用 1 ml 细胞核裂解缓冲液（冷冻）重悬沉淀并在冰上孵育 10 分钟。

8. 继续进行超声处理，同时将样品保持在冰上。 我们使用 15 秒脉冲的超声处理条件，然后是 1 分钟的休息间隔，总超声处理时间为 5 分钟。 脉冲的时间和数量将根据超声波仪、细胞类型和交联程度而有所不同。 理想情况下，DNA 片段的大小应为 300-1000 bp。

9. 将染色质转移到 1.5ml 试管中，并在 14,000 4 °C 下离心 10 分钟或在 -80°C 下冷冻以备后用。

10. 小心地将上清液转移到新管中。

11. 预清除染色质（两种方式）：

一个。  向染色质中加入 50 μl 蛋白 A/G-琼脂糖珠/鲑鱼精子 DNA，并在 4°C 下旋转 1 小时。

湾。 加入 10-15μl 封闭的 Sapha A 细胞，7个并在旋转平台上孵育 15 分钟，4 °C。

12. 在 4°C 下以 14,000 rpm 的速度将染色质离心 5 分钟。 将上清液转移到清洁管中。 注意：等分样品进行控制。 （阴性和模拟）样品体积最好为 200- 500μl。

13. 向染色质样品中加入特异性抗体，并在 4°C 下旋转过夜。

第 2 天

14. 如果您使用的是来自兔以外物种的单克隆抗体或多克隆抗体，请加入 1μg 特异性二抗，在旋转平台上孵育 1 小时。

15. 对应步骤11：

一个。  在冰上的染色质样品中加入 50 μl 蛋白 A/G-琼脂糖珠/鲑鱼精子 DNA 珠。  在 4°C 下旋转 2 小时。

湾。  向每个样品中加入 10 μl 封闭的 Staph A 细胞。  在室温下在旋转平台上孵育 15 分钟。

16. 在 4°C 下以 14,000 rpm 的速度将样品离心 2 分钟。

17. 从 IgG 样品的上清液中取出 15 μl 作为“输入”以备后用。

18. 小心弃去所有样品的上清液。

19. 用 1 ml 透析缓冲液洗涤沉淀两次，用 IP 洗涤缓冲液洗涤 4 次。 每次洗涤时，将样品在旋转平台上孵育 3 分钟，然后离心 1 分钟，小心弃去上清液。 高效洗涤对于降低背景至关重要。

20. 通过加入 50 μl IP 洗脱缓冲液在 RT 和设置 3 涡旋 15 分钟洗脱抗体/蛋白质/DNA 复合物。

21 . 在室温下以 14,000 rpm 离心 3 分钟，然后将上清液转移到干净的试管中。

22. 重复步骤 20-21 一次

25. 以 14,000 rpm 离心样品 5 分钟以去除琼脂糖珠或葡萄球菌 A 细胞。 将上清液转移到干净的试管中。

26. 加入 1 ul 高浓度 RNase A (10 mg/ml) 和 5M NaCl 至终浓度为 0.3 M。将样品在 67°C 水浴中孵育 4-5 小时以逆转甲醛交联。

27. 加入 2 倍半体积的乙醇并在 -20°C 下沉淀过夜。

第 3 天

28. 在 4°C 下以 14,000 rpm 离心样品 15-20 分钟。 去除残留的乙醇，让颗粒完全风干。

29 . 将每个颗粒溶解在 100 ul TE 缓冲液中，然后进行 PCR 检测 和 琼脂糖凝胶电泳 。

辉骏生物使用ChIP-qPCR、ChIP-seq等技术在染色质免疫共沉淀ChIP研究实验技术服务超10年，公司在DNA与蛋白相互作用研究方面经验丰富，自有实验场地，ChIP外包代作服务价格优惠，实验数据已协助发表上千位客户发表高分论文。

辉骏生物提供的ChIP染色质免疫共沉淀服务分为以下两种：

1. ChIP qPCR，用于检测某样本中的诱饵蛋白和待测DNA片段是否结合；

2. ChIP seq，用于筛选某样本中的诱饵蛋白可以结合哪些DNA区域。

添加技术员微信沟通实验

18927549347