想知道您研究的蛋白质是否与另一种蛋白质相互作用吗？  您是否希望您可以聚焦您的蛋白质以确定其结合伙伴？  您可以使用免疫共沉淀 (Co-IP) 来寻找蛋白质的伴侣。

辉骏生物在本文将为您的 Co-IP 实验做好准备，提供一个方便的 CoIP 协议，并讨论您应该包含的 coip 控件。  它还将涉及如何将 Co-IP 与 SPR 应用程序一起使用，以详细了解您的蛋白质如何与其他蛋白质相互作用。

免疫共沉淀实验的基础

从本质上讲，Co-IP 只是传统免疫沉淀的一个更精致的版本，可以认为是一种小规模的亲和纯化。  使用这两种技术，您都可以使用抗原/抗体相互作用来分离蛋白质。  您感兴趣的蛋白质会被抗体“拉下”并从溶液中分离出来，而抗体又会被珠子捕获。

然而，与传统 IP 相比，CoIP 需要更多的护理和更多的生理相关条件。 如果成功，Co-IP 不仅会拉下您感兴趣的蛋白质，还会拉下它的交互伙伴。 因此，Co-IP 是识别蛋白质复合物的好方法。 此外，您可以使用 Co-IP 来确定不同条件下的蛋白质-蛋白质相互作用。 然后，您可以继续使用 SPR 技术 。

一个简单的免疫共沉淀协议

Co-IP 协议与传统的 IP 协议非常相似，不同之处在于 Co-IP 需要更温和的测定条件来保持与结合伙伴的相互作用。  一般步骤如下（图1）。

图 1：标准 Co-IP 协议中的步骤。

1. 裂解你的细胞

在这里，您轻轻地打开您的细胞，使您的蛋白质接触到抗体。  裂解方法在 Co-IP 中很重要。  非去污剂、低盐裂解缓冲液是可溶性蛋白质 Co-IP 的流行选择。  这种裂解最不可能干扰任何蛋白质相互作用。

然而，对于溶解度较低的蛋白质复合物，裂解缓冲液可能需要包含非离子去污剂，例如 NP-40 或 Triton X-100。 留出时间测试多种裂解条件以找到最佳裂解溶液。 科学中的一些东西，比如最好的裂解缓冲液，只需要凭经验确定。

不要忘记使用 蛋白酶抑制剂 ，以免蛋白质被蛋白酶吞噬，蛋白酶也会在细胞裂解过程中释放出来。

数量也很重要：您使用的细胞裂解物越多，您可以提取的蛋白质就越多。  您应该使用的确切数量将根据您的蛋白质的丰富程度、您是否正在拉低过表达的蛋白质或内源性蛋白质以及它与结合伙伴的相互作用程度而有所不同。   一个好的起点是使用至少 1 mg 的总蛋白质，但您可能需要对此进行优化。

蛋白质浓度也很重要 。 Co-IPs 通常在微量离心管中进行，因此您需要确保您的细胞裂解物足够浓缩，以适合所需量的总蛋白和其他试剂，并有移动空间。

2. 添加您的抗体

现在是时候添加针对您感兴趣的蛋白质的抗体了。  为 Co-IP 选择最佳抗体可能很困难，但许多抗体制造商在其产品选择指南中提供了有用的信息。

以下是为 Co-IP 选择优质抗体的一些技巧。

• 使用先前已证明可沉淀蛋白质的抗体（例如，来自文献）。

• 尽可能选择多克隆抗体而不是单克隆抗体。  多克隆抗体将在不同位置结合您的蛋白质，这意味着成功进行 Co-IP 的机会更大，并最大限度地减少潜在问题，例如您的抗体是否识别与您试图寻找的伴侣结合的位点。

• 如果不能选择多克隆抗体，请选择一种抗体，该抗体可识别您感兴趣的蛋白质上未被任何其他蛋白质-蛋白质相互作用掩盖的表位。

• 确保抗体与天然蛋白结合；  一些抗体只识别变性蛋白质。

3. 添加蛋白 A/G 微珠

一般来说，珠子用于物理地从混合物的其余部分中提取和纯化抗体-蛋白质复合物。

您可以使用两种主要类型的珠子：涂有蛋白质 A 的珠子或涂有蛋白质 G 的珠子。蛋白质 A 和 G 是识别和结合抗体的特殊细菌蛋白质。 您也可以得到包被蛋白 A 和蛋白 G 的珠子。抗体的种类和类型将决定您应该使用这两种珠子中的哪一种。 要确定哪一种适合您，请查阅您的抗体数据表。 AbCam 还有 一个有用的表格，显示蛋白质 A、蛋白质 G、蛋白质 A/G 和蛋白质 L 珠的结合概况 。

传统上，免疫沉淀珠是琼脂糖球（直径 50–150 µM），可通过离心纯化抗体-蛋白质复合物。  离心方法包括使用珠浆或离心柱。离心柱通常速度很快，并且作为具有高度优化协议的套件的一部分提供。  但是，它们可能是一个昂贵的选择。另一方面，珠状浆液非常适合需要非常温和的处理且不需要高离心速度的大型复合物。

更现代的技术使用直径为 1–4 µM 的磁珠代替琼脂糖珠。  磁珠可让您通过磁铁分离抗体-蛋白质复合物！   磁珠可能更适合高重量蛋白质复合物和处理小体积样品，以避免在离心过程中过多的样品损失。   但总的来说，琼脂糖珠通常具有较高的产量，因为它们具有连接多种 A/G 蛋白的大表面积。

4.孵化

这是珠子-抗体-蛋白质相互作用发生的时间。  孵化时间从 30 分钟到过夜不等，具体取决于您选择的珠子。  通常，孵育步骤包括温和的搅拌，例如在摇板或管旋转器上以低速进行，因为搅拌会增加相互作用的机会。

5.收集

孵育后，您需要收集抗体-蛋白质复合物。  根据您使用的方法，您将使用磁铁或离心将复合物与其他细胞蛋白分离。

6.洗珠子

既然您的目标蛋白有望通过您的抗体束缚在您的微珠上，那么是时候摆脱裂解物中的所有其他物质了。

清洗抗体-珠子复合物几次，以清除未与抗体特异性结合的细胞物质。  洗涤还有助于减少“粘性”细胞成分与珠子的非特异性结合。

通常，您使用冷裂解缓冲液或冷 PBS 洗涤。  您可能需要优化此步骤以找到不会破坏相互作用蛋白质的正确严格程度。

辉骏提示： 在此步骤中保存所有使用过的洗涤缓冲液。 洗涤缓冲液可以显示您的目的蛋白和任何伴侣蛋白是否已从裂解物中耗尽。 这是对您的 Co-IP 进行故障排除的关键知识！

7. 洗脱您的蛋白质

大多数 SDS-PAGE 上样缓冲液会减少和变性蛋白质。  因此，将蛋白质与珠子分离通常是一种有效的方法。  如果您计划使用 SDS-PAGE 作为您的检测方法（我们大多数人都这样做），那么您可以直接将负载添加到珠子上以收集您的蛋白质。

如果您想使用天然 PAGE 协议检测您的蛋白质，或者您计划对分离的蛋白质进行酶测定，那么您可能需要使用 SDS-PAGE 上样缓冲液以外的其他物质进行洗脱。

常用的非变性洗脱缓冲液是 0.1M 甘氨酸，低 pH 值（约 2.5–3）。  然而，一些蛋白质在这些条件下仍然会变性或失去酶活性，并且一些蛋白质可能不会通过这种处理解离。  因此，将其归结为另一个实验步骤。

8. 检测您的蛋白质

至此，您已经分离出您的蛋白质，可以开始使用了。  现在是令人兴奋的部分……看看你分离的感兴趣的蛋白质及其舞伴。  想怎么做SDS-PAGE、质谱、酶分析等取决于你。

辉骏提示： 请记住，您用于纯化蛋白质的抗体也与您的目标蛋白质一起在洗脱液中。 这种抗体污染可能是个问题。 蛋白质印迹可能会检测到您的洗脱液中的抗体，因此如果您的目标蛋白质的分子量接近，则它们会掩盖对它们的检测。 （抗体重链和轻链的分子量分别约为 50 和 25 kD。）

您可以通过 1) 使用与抗体共价结合的磁珠，或 2) 确保为您的蛋白质印迹选择的二抗识别与您的 Co-IP 抗体不同的物种，从而克服这个问题。

9. 研究与表面等离子共振应用的相互作用

Co-IP 中的积极发现是个好消息，但你应该缓和你的兴奋。 许多科学家被粘性蛋白质误入歧途。 您应该进行额外的研究以确认任何潜在的相互作用并确保它们是特定的。 例如，您可以使用突变分析来绘制结合位点图。 或者，有关交互的更具体信息，请考虑使用 SPR 应用程序 。

SPR 应用程序不仅可以确认结合伙伴之间的相互作用，还可以实时定量测量这些相互作用的亲和力、热力学和动力学。

SPR 生物传感器 有助于对感兴趣的相互作用进行热力学分析。 使用 SPR，您可以自信地比较您感兴趣的蛋白质和不同结合伙伴之间的亲和力。SPR 的一个主要实际优势是您不需要标记您感兴趣的蛋白质（因此不再需要标记克隆或放射性），从而为您节省时间并避免使用棘手的克隆策略带来的潜在麻烦。

如果您想检测和解开免疫受体与其配体之间的相互作用，您可能需要考虑尝试 生物传感器分析 。生物传感器分析允许您测量配体与其特定抗原受体的结合和解离速率。 这些测定遵循 SPR 原则。 由于其优势和巨大的能力，SPR 及其相关应用已成为动力学和亲和力测定的黄金标准，而 SPR 原理强调了大多数基于颜色的 生物传感器芯片 应用。

免疫共沉淀对照

控制对于了解您的实验是否有效并在事情没有完全解决时进行故障排除至关重要。  您可以为 Co-IP 使用多种不同的控件（图 2）。

图 2：免疫共沉淀的示例对照

阴性对照

这些控件表明您在实验中看到的任何交互都是有效的。  使用涂有非特异性抗体的珠子，在您的裂解物中孵育并与您的样品一样处理。  最好从与实验中的抗体相同的物种中选择一种，以更好地模拟任何非特异性结合。

您也可以只使用没有任何抗体的琼脂糖珠，反之亦然，以确定任何非特异性结合的确切原因。

如果您在此对照中看到您感兴趣的蛋白质或潜在的结合伙伴，则您有非特异性结合，您需要查看您的协议。

阳性对照

检查总裂解物中是否存在您的蛋白质/潜在结合伴侣（未进行任何珠子/Co-IP）。  这可以确保如果您没有看到您感兴趣的蛋白质，这不是由于裂解物或检测方法的问题。如果您的蛋白质在总裂解物中，但不在 IP 中，则需要对每个步骤进行故障排除以确保 IP 正常工作。纯化的重组蛋白可用于确保您的检测方法有效——这可能适用于被拉下的蛋白质或潜在的相互作用蛋白质。

coip免疫共沉淀实验的更多提示

当然，在这些步骤中，有很多变数可以让你的 Co-IP 成功，或者最后让你一脸悲伤。  并且有无数的公司、产品和套件可供您选择。  因此，为一些试验和错误做好准备！

在我们结束之前，这里有一些专家提示，可以巧妙地窥探您的蛋白质相互作用，而不会过多地打扰它们。

预先清除您的裂解物

在引入抗体之前，通过在裂解物中添加蛋白 A/G 珠子来“预清除”您的裂解物。  接下来，旋转珠子并丢弃它们，以拉出任何非特异性粘附在珠子上的细胞成分。  然后添加您的抗体/珠子并继续。

预清除有助于减少非特异性结合并降低潜在背景。  但是，如果您计划在 Co-IP 结束时使用蛋白质印迹法检测您的蛋白质，则可能不需要预先清除，除非您知道污染蛋白质可能会干扰您的蛋白质/感兴趣的条带。

仔细计划订单

将磁珠引入抗体是影响产量的重要变量。  通常，抗体通过在引入裂解物之前将它们一起孵育而固定在珠子上。  但是，如果目标蛋白的浓度较低，或者抗体对目标蛋白的亲和力较弱，则可能需要先孵育蛋白和抗体，然后再添加磁珠。

温柔一点，慢一点

您的目标是保持蛋白质与蛋白质的相互作用。  您的抗体-蛋白质复合物将被蛋白 A 或 G 结合珠从溶液中物理拉出。  虽然从珠子到抗体的束缚是高度特异性的，但它是脆弱的。

因此，请用天鹅绒手套处理您的细胞裂解物。  这包括选择正确的裂解方法、保持样品冷藏以及避免过度处理。

涡旋、用小移液器吸头混合或在离心机中使用高速旋转都可以分解您的蛋白质-抗体-珠子链，并将您的蛋白质抛回溶液中。

保持温度

为防止裂解物中的蛋白质降解或改变，请在 4°C 下进行 CoIP。  冷藏室是完美的，特别是如果您可以将所有设备（例如，摇杆/离心机）设置在触手可及的地方。

免疫共沉淀总结

Co-IP 是一种有用且相对简单的工具，可用于识别蛋白质-蛋白质相互作用。本文中提供的coip实验协议和技巧希望能帮助确保您获得出色且有意义的结果！

辉骏生物提供的Co-IP免疫共沉淀服务分为以下两种：

1. Co-IP WB，用于检测某样本中的诱饵蛋白和待测蛋白是否存在相互作用；

2. Co-IP MS，用于筛选某样本中的诱饵蛋白与哪些蛋白具有相互作用。

加技术专员微信了解Co-IP实验周期、优惠等

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免疫共沉淀CoIP实验服务—辉骏优势

1. 近十年服务经验，服务客户众多，案例发表在Nature Cell Biology、Nature Plants、Cancer Research等知名期刊上。

2. 对蛋白互作的筛选鉴定理解深刻，擅长针对客户具体情况提出合适的方案建议。

3. 自有分子及细胞生物实验平台，能有效制定并执行最优的实验路线。

4. 自有蛋白质组学平台，对微量CoIP实验产物的质谱鉴定有十足的把控能力，对后续的生物信息分析有独到的见解。

5. 售后技术支持将一直保持到客户发表文章，确保客户安心免疫共沉淀下游实验及投稿。

免疫共沉淀coip实验结果图例—辉骏生物

Co-IP WB：Western blot检测图（阳性）

Co-IP MS：Western blot检测图（阳性）

Co-IP MS：质谱检索表格（部分展示）

Co-IP（免疫共沉淀）技术实验—辉骏生物客户文章

1. Li H.B. et al: The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signaling. Nature Plants. 2019，IF=13.256. 【研究内容】：客户发现，作为内体蛋白分选转运复合体成分之一的FREE1基因，受到脱落酸刺激时候会发生磷酸化并移位到细胞核。客户利用酵母双杂交技术找到两个核蛋白ABF4 and ABI5会与FREE1结合，免疫共沉淀CoIP实验进一步证实了FREE与这两个蛋白的互作。后续实验表明，FREE1通过抑制ABF4、ABI5对下游基因的调控能力，参与了脱落酸信号通路。 使用相关技术：质谱鉴定、免疫共沉淀CoIP、Co-IP MS实验

2. Jiang, S. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP. Cancer Research.2019，IF= 9.727. 【研究内容】：客户利用蛋白质组学技术，筛选出胆固醇致前列腺癌发生上皮间质转变（EMT）的重要基因APMAP和EGFR。通过在前列腺癌细胞表达3*Flag-APMAP基因，并利用免疫共沉淀CoIP及质谱鉴定技术，客户发现EPS15R可与APMAP结合。进一步的研究证实，体内EPS15R-APMAP复合物通过EGFR致使细胞发生EMT。 使用相关技术：蛋白质组学、质谱鉴定、免疫共沉淀CoIP

3. Huang C.Y. et al: UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. 2020 , IF=10.717. 【研究内容】：前期研究表明UBAP2L蛋白参与应激颗粒形成。客户在这项研究中，用免疫共沉淀结合质谱等技术，发现PRMT1甲基化UBAP2L，UBAP2L蛋白并且和另外三个应激颗粒形成有关的重要蛋白有相互作用。这些蛋白复合物介导了应激颗粒的形成。 使用相关技术：CoIP技术服务、质谱鉴定、修饰位点鉴定

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