纯化的 RNA 样本是当今许多广泛使用的检测的重要起点，从 RT-qPCR 到下一代测序。  虽然从细胞样本中提取和纯化 RNA 的主要方法只有三种，但在分离 RNA 时，有无数注意事项可以帮助您优化工作流程。  辉骏生物在本文列举了一些纯化高质量 RNA 的方法技巧，以提高您对后续检测结果的信心。

RNA提取纯化的主要方法

虽然提取方法的选择有时取决于样品类型，但通常这三种方法可用于大多数样品。  即使是更难裂解和提取 RNA 的细胞类型，如细菌、植物和酵母，也可以使用额外的裂解步骤成功提取。

1.苯酚/氯仿法

这是最古老、久经考验的提取 RNA 的方法。   它使用简单但费力的方案，该方案依赖于分子种类在有机溶剂和水中的不同溶解度。  苯酚/氯仿方法可以容纳更大的样品，但它的整体性较低且不易自动化。孵育时间和沉淀温度很重要，他使用低温来保护 RNA 免受 RNA 酶的降解。 应注意不要干扰过程中形成的相[以防止 DNA 或蛋白质污染 RNA，因此需要良好的处理能力，苯酚/氯仿方法通常会产生更清洁的 RNA，并允许从较少量的细胞中提取 RNA与下面的离心柱方法相比。

2.自旋柱/柱色谱法

离心柱方法使用包含硅胶过滤柱的小型离心管。  用 RNase 抑制剂和高盐浓度处理的裂解样品在离心过程中通过离心柱，而 RNA 仍然与柱内的二氧化硅结合。  洗涤去除杂质，然后用水从硅胶过滤器中洗脱纯化的 RNA。

离心柱以方便的试剂盒形式广泛使用，通常使用简单、快速的方案。  但这可能会因样品裂解或均质化不完全或过滤器过载而变得复杂。使用适量的输入材料很重要，因为使用过多的样品可能会降低裂解效率，引入过量的 RNA 以外的细胞成分，并损害 RNA 与 RNA 纯化柱的结合。自动化是可能的，但不如自动化磁珠方法方便。

离心柱法仅适用于小样本，但可以使用各种树脂通过柱层析纯化大量的 RNA（例如克到千克）。  纯化工作流程中最重要的一步是优化上样和洗脱步骤以获得最佳容量和产量，同时保持高纯度。

通过柱层析纯化 mRNA 时，优化盐浓度尤为重要。在较高的盐浓度下，mRNA 可以沉淀或形成更高级的结构，如 dsRNA。在为 oligo(dT) 亲和力柱制定加载方案时，首先确定 mRNA 沉淀或形成双链的盐浓度是有帮助的，因为低于此浓度的加载有助于恢复和纯度。与 oligo(dT) 结合所需的盐含量与需要中和的核苷酸数量有关。

3.磁珠法

该方法使用涂有二氧化硅或其他结合 RNA 的配体（例如 oligo(dT)）的磁珠来分离具有完整 polyA 尾巴的 mRNA 分子。将珠子与细胞裂解物和 RNase 抑制剂一起孵育，然后使用磁场将其固定到位，同时去除上清液（含有不需要的碎片和杂质），并洗涤珠子以去除残留的杂质。 将珠子重新悬浮在水中会洗脱纯化的 RNA。

这是一个快速、简单的协议，易于自动化进行高通量工作。  没有过滤器柱消除了对过滤器堵塞或过载的担忧。  更粘稠的样品可能会带来挑战，因为在孵育过程中珠子和 RNA 可能更难以接触。