在RNA-蛋白（RNP）互作研究中，仅筛选获得潜在目标RNA结合蛋白（RBP）并非研究终点，其仅为后续机制研究的基础铺垫。精准筛选并鉴定目标RBP特异性结合的靶标RNA，是解析RBP转录后调控机制、提升科研论文学术价值与创新性的核心环节，直接决定课题研究方向的准确性与实验数据的有效性。

目前，目标蛋白结合RNA的主流研究范式为：通过文献挖掘及RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）等高通量技术，筛选获得目标RBP的潜在结合候选RNA，再利用RNA免疫沉淀-实时荧光定量PCR（RIP-qPCR）技术验证二者结合的特异性，最终锁定目标靶标RNA。

本文结合SCI经典文献与辉骏生物专属技术方案，系统详解目标蛋白结合RNA的鉴定与验证流程，精准拆解实验分组设计、结果统计学分析及核心数据解读要点，助力科研工作者高效推进相关实验研究。辉骏生物旗下优质RIP试剂盒、RNA pull-down试剂盒及一站式技术服务，助力无数科研人突破瓶颈并发表高分SCI，如有RNA-蛋白互作相关技术疑问或产品订购需求，欢迎随时咨询。

 目标蛋白结合RNA应用案例 

案例1：ZmBFF1蛋白结合的RNA是U1 snRNA

（1）RIP-seq测序分析发现ZmMBF1蛋白与U1 snRNA显著富集（图1A）。

（2）RIP-qPCR实验证实ZmMBF1-HA蛋白与U1 snRNA存在直接相互作用（图 1B，由辉骏生物提供RIP试剂盒）。

（3）BiFC（双分子荧光互补技术）及LCI（荧光素酶互补成像）蛋白-蛋白相互作用实验证实，ZmMBF1蛋白在植物细胞中与U1-70K蛋白存在相互作用（图1C、1D）。

图1 引自[辉骏生物客户文章] Hao S, Han S, He Z, et al. Genomic basis underlying alternative transcripts-mediated drought tolerance in maize. Genome Biol 27(1):47(2026). 

案例2：ACAT1蛋白、PSMD14蛋白结合的RNA是circUBR5

（1）RNA pull-down MS筛选发现生物素标记的circUBR5显著富集ACAT1蛋白、PSMD14（图2A、2B）。

（2）RPISeq预测circUBR5与ACAT1存在高概率相互作用（随机森林得分=0.8，图2C）。

（3）RNAfold与3dRNA分别预测circUBR5二级、三级结构，结合PDB数据库中ACAT1结构，经HDOCK分子对接明确二者相互作用界面（图2D）。

（4）RIP实验证实ACAT1蛋白与circUBR5存在特异性结合（图2E，由辉骏生物提供RIP试剂盒）。

（5）RNA pull-down MS分析发现circUBR5结合伙伴中存在去泛素化酶PSMD14蛋白（图2B）。

（6）RIP实验证实PSMD14蛋白与circUBR5存在直接结合（图2F，由辉骏生物提供RIP试剂盒）。

图2 引自[辉骏生物客户文章] Jiang Y, Zhao Z, Ma L, et al. Exosomal circUBR5 drives metastasis and chemoresistance in gastric signet-ring cell carcinoma by reprogramming cholesterol metabolism through the hsa-miR-1208/CYP19A1 axis and ACAT1 upregulation. Cancer Lett 641:218279(2026).

案例3：NACA蛋白特异性结合的RNA是lnc-GD2H

（1）RNA pull-down MS分析鉴定出生物素标记的lnc-GD2H的潜在RNA结合蛋白是NACA（图3A-3C）。

（2）RPISeq数据库分析显示，lnc-GD2H与NACA蛋白存在高概率相互作用（RF和SVM分类器值>0.5，概率>0.5被认为是“正”，图3D）。

（3）RIP-qPCR实验证实NACA蛋白可特异性结合lnc-GD2H（图3E，由辉骏生物提供RIP试剂盒）。

图3 引自[辉骏生物客户文章] Chen R, Lei S, She Y, et al. Lnc-GD2H Promotes Proliferation by Forming a Feedback Loop With c-Myc and Enhances Differentiation Through Interacting With NACA to Upregulate Myog in C2C12 Myoblasts. Front Cell Dev Biol 9:671857(2021). 

RIP技术流程

（1）细胞裂解：释放RBP-RNA复合物。

（2）Input制备：取30 μL作为蛋白 input，取30 μL作为RNA input。

图4 RIP实验分组设计图-辉骏生物

（3）RIP：抗体结合目标RBP，磁珠捕获复合物。

（4）洗涤：去除未结合RNA片段。

（5）洗脱：得到“蛋白-RNA互作复合体”。

（6）RNA提取纯化：试剂盒或者Trizol提取RNA。

（7）RNA分析：提取后的RNA、RNA input可用于qPCR实验或高通量测序。

图5 RIP技术流程图-辉骏生物

 RIP实验结果解读 

RIP结果解读1

作者为分析METTL14蛋白与RNA的结合特性，利用RIP-qPCR进行检测，通过诱饵蛋白METTL14分离METTL14-RNA复合物，成功获得目标复合物（图A）。进一步检测发现，在METTL14组中，AQP3相对于IgG组的富集度约为83.6倍，表明AQP3可与METTL14特异性结合（图B）。

图6 引自[辉骏生物客户文章] Nong Y, Zhai Q, Liu W, et al. AQP3 Influences Unexplained Recurrent Abortion by Regulating Trophoblast Cell Migration and Invasion via the METTL14/IGF2BP1/AQP3/PI3K/AKT Pathway. J Cell Mol Med 29(3):e70325(2025). 

RIP结果解读2

作者为探究LTA4H对HNRNPA1蛋白与RNA结合特性的调控作用，采用RIP-qPCR技术进行检测，以HNRNPA1为靶蛋白富集HNRNPA1-RNA复合物。结果显示，相较于对照组，LTA4H过表达组中Ltbp1 mRNA 的富集程度显著降低，表明 LTA4H过表达可减弱HNRNPA1与Ltbp1 mRNA 的相互作用（图H）。

图7 引自[辉骏生物客户文章] Yang S, Qiu X, Yang Y, et al. LTA4H improves the tumor microenvironment and prevents HCC progression via targeting the HNRNPA1/LTBP1/TGF-β axis. Cell Rep Med 6(3):102000(2025).

 RIP实验常见问题 

Q1：想做miRNA-RNA互作验证，可以如何设计RIP实验？

如果想验证ceRNA机制，可以用anti-Ago2抗体进行RIP实验。

① 先在正常条件下进行RIP，验证Ago 2可结合目标RNA和miRNA，暗示目标miRNA和RNA与ceRNA机制有关；

② 然后过表达/抑制miRNA或靶mRNA，再进行anti-Ago2 RIP，检测RIP产物中富集的目标miRNA和RNA量是否随之变化。

③ 通过RNA pulldown（标签法）和荧光素酶报告基因实验可进一步验证miRNA-RNA的互作。

Q2：RIP抗体选择有什么要求？为什么要求IP和IgG抗体种属一致？

需选择IP级抗体，建议IP抗体和IgG抗体选择相同种属，如IP抗体是兔源，IgG也应选择兔源。IgG组是阴性对照也是同型对照，需与IP抗体同种属来源、同剂量、同亚型，以消除由于抗体非特异性结合而产生的背景信号。

Q3：WB分析RIP的蛋白产物，为什么Input、IP和IgG都有条带，且位置在约25 kd或者55 kd？

可能存在IP抗体的轻重链干扰；解决方法：①WB检测时使用HRP 直接标记的一抗；②选用仅识别天然构象抗体的二抗进行 WB；③WB采用特异性识别抗体轻链或重链的二抗；④内源Co-IP实验可直接选用IP专用二抗；⑤标签Co-IP使用标签纳米抗体磁珠（Flag，HA，V5，GFP，RFP可选）等进行IP。

需要IP专用二抗、标签纳米抗体磁珠的同学们可以联系辉骏生物~

Q4：RIP-qPCR出不来结果或CT值都接近40，怎么办？

①检查样本中目标蛋白和RNA的内源性表达量，若表达量较低，建议考虑过表达后再做RIP；

② 检查抗体是否IP级抗体及其特异性和活性；

③ 如果样本降解，建议重新准备样本和RIP实验，注意低温操作；

④ 可尝试加大起始细胞量，如加大到2×10*7或3×10*7细胞。

Q5：RIP-qPCR结果IP和IgG组相差不大，是什么原因呢？

① IP抗体失效：先WB验证RIP蛋白产物，确认IP组正常下拉目的蛋白，可正常富集蛋白结合的RNA；确认IgG组无下拉目的蛋白，不能富集蛋白结合的RNA。否则可能是抗体的问题，建议确认IP级抗体的特异性和活性。

②非特异性结合：若IP和IgG组均富集了相当量的目的RNA，可能存在非特异性结合，建议洗涤步骤采用较强的Buffer C，减少孵育时间，增加洗涤次数。

③ 在某些条件下目的蛋白与RNA不结合。

 辉骏生物RIP实验服务优势 

辉骏生物在RNA-蛋白（RNP）、蛋白-蛋白（PPI）、DNA-蛋白（DPI）互作研究领域已深耕十五余年，聚焦科研课题核心需求，为各类互作相关研究提供全流程技术解决方案，覆盖课题开展全周期，助力科研工作者高效突破实验瓶颈。

依托自有标准化质谱检测平台，辉骏生物可高效完成RNA免疫沉淀（RIP）产物的高通量测序，同时提供深度生物信息学分析服务，精准解析测序数据背后的生物学意义，为实验结论提供可靠的数据支撑。

此外，其可提供从课题实验设计、实验方案优化、实验操作实施，到数据整理、论文撰写及修改发表的全链条技术支持，目前已助力客户将研究成果发表于上百篇国际高水平期刊，是互作研究领域极具公信力的科研合作伙伴。

 辉骏生物RIP试剂盒 

以上是本期核心内容，辉骏生物深耕蛋白互作领域十余载，供应Flag/HA/V5/GFP/RFP等纳米抗体磁珠、IP专用二抗、各类标签抗体、内参抗体及蛋白互作试剂盒，提供RIP、Co-IP等互作实验及蛋白检测服务，相关技术咨询与产品订购可随时沟通。

 辉骏生物简介 

广州辉骏生物科技股份有限公司（Fitgene）成立于2011年，超15年科研服务经验，专业提供蛋白（抗体）和互作实验服务，包括蛋白质谱检测、蛋白/RNA/DNA/化合物等分子间相互作用检测、抗体稳定表达株构建、基因敲除和过表达细胞株构建等；同时还研发了纳米抗体磁珠、IP专用二抗、互作试剂盒、标签抗体等科研产品。

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目前，客户已在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF: 52.7）、Journal of Hematology & Oncology（IF: 40.4)、European Heart Journal （IF: 35.7）、Molecular Cancer（IF: 33.9）、Cell Discovery （IF: 33.5）、Nature Methods（IF: 32.1）等高水平期刊成功发表大量高分文章。