质谱是解析蛋白质翻译后修饰（PTMs）核心工具，依托 “特异性富集 - 高分辨检测 - 智能算法” 体系，可揭示蛋白动态修饰网络，突破低丰度修饰肽段检测限制、精准定位调控位点。液质联用（LC-MS/MS）结合数据库检索，可鉴定磷酸化、甲基化、泛素化等已知修饰及小分子药物蛋白修饰位点。检测特定蛋白修饰位点前，可通过 IP、亲和纯化、SDS-PAGE 分离纯化目的蛋白，同步检测 8 种已知修饰。

辉骏生物在本文重点讲解 SCI 文献中 IP-MS 鉴定磷酸化、甲基化、泛素化位点方法，助力实验高效开展。辉骏生物凭借多平台检测技术，提供样本处理至深度数据分析全流程方案，定制化修饰组学服务及跨学科技术融合，可提升修饰位点鉴定效率。IP-MS、LC-MS/MS 修饰位点鉴定技术咨询及产品订购可随时联系！

LC-MS/MS修饰位点技术流程

（1）样品制备：提取生物样品蛋白，IP富集。 （2）蛋白酶解：胰蛋白酶等酶解为肽段。 （3）质谱及数据分析：LC-MS/MS鉴定，数据检索分析修饰肽段与位点。

LC-MS/MS修饰位点鉴定 * 辉骏客户案例

IP-MS磷酸化关键位点鉴定

PhosphositePlus显示KIAA1429存在明显磷酸化修饰（图1A）。

IP-MS（辉骏生物提供技术支持）鉴定其丝氨酸1579位点显著磷酸化（图1B）。

过表达KIAA1429上调自身泛丝氨酸/苏氨酸磷酸化（p-S/T）水平（图1C）。

免疫荧光显示p-S/T与KIAA1429在细胞质共定位（图1D）。

序列分析表明KIAA1429的Ser1579位点在多物种中高度保守（图1E）。

据此构建1579位丝氨酸突变为丙氨酸的质粒（1579S）（图1F）。

过表达突变质粒KIAA1429-SA可显著下调该位点p-S/T修饰（图1G）。

免疫荧光显示KIAA1429核质定位存在明显差异（图1H）。

本研究经数据库预测、IP-MS筛选及功能验证，证实KIAA1429的Ser1579可发生磷酸化，且该修饰是调控其核质分布的关键。

图1 LC-MS/MS鉴定磷酸化位点

IP-MS甲基化关键位点鉴定

IP-MS发现PRMT3高度富集HSP60（HSPD1编码）（图1A）。

Co-IP证实二者相互作用（图1B），免疫荧光显示互作位于细胞质（图1C）。

Co-IP表明敲除PRMT3或SGC707处理可抑制HSP60的ADMA修饰（图1D、1E），过表达PRMT3则增加其ADMA修饰（图1F），证实PRMT3调控HSP60精氨酸甲基化。

IP-MS（辉骏生物提供技术支持）确定HSP60唯一甲基化位点为R446（图1G），该位点多物种保守且匹配甲基化共识基序（图1H）。

Co-IP显示Flag-HSP60-RK突变体ADMA修饰消除（图1I、1J），敲除PRMT3或SGC707抑制可降低HSP60寡聚化（图1K、1L）。

本研究证实HSP60是PRMT3新底物，PRMT3通过甲基化其R446位点调控寡聚化。

图2 LC-MS/MS鉴定甲基化位点

IP-MS泛素化关键位点鉴定

LC-MS/MS筛选出E3泛素连接酶RNF213与TRIM25（1a）。

TCGA-KIRC及IHC显示TRIM25在ccRCC中显著上调，RNF213无明显关联（1b、1c）。

功能实验表明TRIM25促进LC3降解（1d、1e）。

CoIP与GST pull-down证实TRIM25与LC3相互作用（1f、1g）。

K51R突变完全消除LC3B泛素化，确定K51为主要位点（1h）；TRIM25介导LC3B的K63型多泛素化（1i），体外实验验证其直接催化作用（1j）。

结论：TRIM25直接介导LC3B K51位点K63连接型多泛素化。

图3 LC-MS/MS鉴定泛素化位点

LC-MS/MS蛋白修饰鉴定常见问题

Q1：蛋白修饰鉴定，能鉴定到具体的修饰位点吗？

蛋白修饰鉴定可以鉴定到具体的修饰肽段和修饰位点，但能否成功鉴定到目标蛋白的修饰情况，主要取决于目标蛋白的丰度（富集效果）、修饰肽段的丰度等。

Q2：对于不常见的修饰，LC-MS/MS能鉴定到吗？

可以鉴定。但如果是不常见修饰，需要客户提供修饰基团的分子式和分子量、与哪个氨基酸反应及反应式，用于推算出修饰基团在连入肽段后的分子式和分子量，以便设置检索条件。

Q3：为何质谱只测到部分序列，数据可信吗？ 

可信。受酶解回收率、肽段大小、修饰影响酶解、离子化效率限制，仅部分肽段可被检测；数据库比对打分即可定性蛋白。辉骏生物可提供纯度＞95%样本的蛋白从头测序服务。

质谱仅需检测部分蛋白序列即可定性，受酶解回收率、酶切片段大小、修饰影响酶解、肽段离子化效率限制，经数据库比对打分输出可信蛋白。

辉骏生物可提供蛋白从头测序服务，要求样本纯度＞95%。

Q4：质谱结果鉴定到很多蛋白，如何评估蛋白的可信度，或者如果筛选蛋白进行后续研究？

辉骏生物提供的鉴定表格含原始与过滤蛋白列表，过滤列表（pep_expect＜0.05）均为可信蛋白，按得分排序，得分越高可信度越高。IP/pull-down实验中，低丰度功能蛋白得分可能偏低，建议优先依据功能，再参考得分。

LC-MS/MS修饰位点送样要求 * 辉骏生物交付结果

IP样本的质谱检测服务 

IP富集后，经变性或非变性洗脱后得到的蛋白产物，以溶液或胶条形式送样。

交付结果 

1.蛋白和肽段鉴定表格（含修饰肽段及修饰位点）；2.质谱检索网页；3.指定肽段的质谱图；4.质谱原始数据；5.实验报告。

★★★ 辉骏生物在IP、Pull down蛋白样本的质谱检测领域，已积累十余年成熟服务经验。凭借专业的技术实力与严谨的实验把控，客户已在Nat Commun、Cell Discov、Mol Cancer等国际知名期刊上，成功发表上百篇SCI论文。如果您有相关样本送样检测需求，欢迎随时联系，我们将为您提供高效、可靠的科研技术支持！

LC-MS/MS蛋白鉴定 * 辉骏生物服务优势

参考文献

[1]Li H, Li Y, Zhao Q, et al. The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signalling. Nat Plants. 2019;5(5):512-524.

[2]Shi Y, Wu Z, Liu S, et al. Targeting PRMT3 impairs methylation and oligomerization of HSP60 to boost anti-tumor immunity by activating cGAS/STING signaling. Nat Commun. 2024;15(1):7930. Published 2024 Sep 10.

[3]Lan W, Chen X, Yu H, et al. UGDH Lactylation Aggravates Osteoarthritis by Suppressing Glycosaminoglycan Synthesis and Orchestrating Nucleocytoplasmic Transport to Activate MAPK Signaling. Adv Sci (Weinh).

广州辉骏生物（Fitgene）2011年成立，15+年科研服务经验。提供蛋白质谱、分子互作、抗体株/基因编辑细胞株构建等服务，自研纳米抗体磁珠、IP二抗、试剂盒等产品。自有实验平台，结果真实可靠，售前方案专业，售后支持至文章发表。

目前，客户已在Signal Transduction and Targeted Therapy (IF: 52.7）、Journal of Hematology & Oncology (IF: 40.4)、European Heart Journal (IF: 35.7）、Molecular Cancer (IF: 33.9）、Cell Discovery (IF: 33.5）、Nature Methods (IF: 32.1）等高水平期刊成功发表大量高分文章。