已知一个目标RNA，如何找到它的结合蛋白？已知一个目标蛋白，又如何筛选与它互作的RNA？

RNA-蛋白互作是研究RNA稳定性、剪接及翻译调控的重要方向，也是SCI论文中常见的分子机制研究思路。那么如何研究RNA与蛋白的相互作用关系？

辉骏生物从RNA/蛋白怎么筛、互作怎么验证、关键区域和位点怎么找，以及Nature Communications文献应用案例几个方面，讲清楚RNA-蛋白互作的完整研究思路。

前期筛选：找到RNA的潜在结合蛋白

如果已知目标RNA，但不知道它与哪些蛋白结合，可以通过RNA pull-down MS筛选潜在RNA结合蛋白（RBP）。

图1 RNA pull-down MS筛选circUBR5的潜在结合蛋白

如果已知目标蛋白，但不知道它与哪些RNA结合，可以通过RIP-seq筛选潜在互作RNA。

图2 RIP-seq筛选SMARCB1的潜在互作RNA

简单来说，RNA pull-down MS解决“已知RNA找蛋白”；RIP-seq解决“已知蛋白找RNA”。

验证RNA与蛋白是否存在互作

1、RIP-qPCR：体内验证结合

RIP利用目标蛋白抗体富集RNA-蛋白复合物，再通过RT-qPCR检测目标RNA的富集情况。

• 实验分组：

✅Input组：检测起始样本中的目标RNA。

✅IgG组：判断非特异性富集背景。

✅IP-YTHDC1组：检测circNSUN2是否被富集。

• 实验结果：

与IgG组相比，IP-YTHDC1组中circNSUN2显著富集，说明YTHDC1蛋白与circNSUN2存在互作。

图3 RIP-qPCR验证circNSUN2与YTHDC1蛋白互作

2、RNA pull-down WB：体外验证结合

利用生物素标记的目标RNA富集结合蛋白，再通过WB检测候选RBP。

注：F2标记RNA的方法为辉骏生物自主研发（已发表专利，有高分文章引用），利用一段只有16nt的RNA标签“F2”与目标RNA连接，标记更加简单，体外和体内标记均可

• 实验分组：

✅Input组：检测hnRNPF蛋白是否存在。

✅Antisense组：反义RNA探针，阴性对照。

✅Sense组：LINC01189正义RNA探针，检测hnRNPF是否被富集。

• 实验结果：

与Antisense组相比，LINC01189组有条带，说明LINC01189与hnRNPF蛋白存在相互作用。

图4 RNA pull-down验证hnRNPF蛋白与LINC01189存在互作

以上两种技术是目前文章中比较常用的RNA-蛋白互作验证的技术手段（辉骏生物均可提供服务和试剂盒）。两者结合可以形成相互补充的互作证据。

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进一步定位关键结合区域和位点

1、RNA截短：寻找关键结合区域

如果目标RNA较长，可以构建不同长度的RNA截短片段，通过RNA pull-down WB定位关键结合区域。

以lncRNA LINMAC与HDAC1互作为例：

✅对照组：Antisense反义RNA探针。

✅实验组：LINMAC不同截短体。

结果表明，LINMAC的1–391、1–150和90–150nt组能够富集HDAC1，说明90–150nt区域是关键结合区域。

图5 RNA截短结合RNA pull-down WB定位关键区域

2、位点突变：锁定关键结合位点

确定关键区域后，可以结合RNA二级结构预测、保守性分析及RBP结合motif，筛选潜在结合序列。

随后构建RNA位点突变体，通过RNA pull-down WB或RIP-qPCR检测互作变化。

注意：RNA截短或突变可能改变二级结构，需要结合结构预测和适当对照综合判断。

验证RNA-蛋白互作的生物学功能

证明RNA与蛋白存在互作后，还需要回答：二者结合后，会产生什么功能影响？

1、RNA稳定性实验

如果怀疑RBP影响RNA稳定性，可以敲低或过表达候选蛋白，再通过Actinomycin D实验检测RNA降解速度及半衰期。

例如敲低IGF2BP1后，LIN28A mRNA降解加快、半衰期缩短，表明IGF2BP1参与维持LIN28A mRNA稳定性。

图6 Actinomycin D检测LIN28A mRNA稳定性

2、基因表达调控

通过敲低或过表达RBP，检测下游靶基因表达变化。

✅qPCR： 检测mRNA表达水平。

✅WB： 检测蛋白表达水平。

图7 RNA结合蛋白调控下游基因表达

Nature Communications文献案例

下面来看一个完整的RNA-蛋白互作研究案例。

RNA pull-down MS：筛选鉴定出circE7的潜在结合蛋白是ACC1（图8A）。

RNA pull-down WB：证实circE7与ACC1蛋白存在互作（图8B）。

RIP-qPCR：进一步证实ACC1蛋白与circE7在细胞内存在互作（图8C）。

蛋白截短：证实ACC1的MT1区域是二者互作的关键区域（图8D、E）。

RNA缺失突变：证实circE7的DEL-1区域是二者互作的关键区域（图8F、G）。

功能实验：表明circE7可能通过调控ACC1磷酸化影响其活性（图8H）。

这个案例基本就是一条典型路线：RNA pull-down MS筛选 → RNA pull-down WB验证 → RIP-qPCR验证 → 截短及缺失突变定位 → 功能实验。

图8 circE7与ACC1蛋白互作验证

研究RNA与蛋白的相互作用，可以简单记住“筛选 → 验证 → 定位 → 位点 → 功能”，逐步验证，就能够构建一条较完整的RNA-蛋白互作调控机制。

如有RNA pull-down MS/WB、RIP-seq/qPCR等相关技术疑问或试剂盒订购需求，欢迎随时咨询辉骏生物～