质谱在蛋白质鉴定和其他实验中起着重要作用，然而，目前的应用并不是特别广泛。辉骏生物收集了以下一些质谱鉴定的常见问题，希望对您的质谱鉴定实验更好的理解有所帮助：

Q1：一级质谱仪和二级质谱仪有什么区别？  以及如何选择合适的？
A：质谱鉴定的主要手段主要是指肽质谱指纹图谱（PMF），即应用质谱法准确测量酶促片段的分子量和比对鉴定蛋白质的文库，对肽段序列进行鉴定，结合PMF结果，实现对蛋白质的鉴定。   二级质谱可以得到部分肽段的短序列，可靠性更高。随着当前期刊对数据要求的日益严格，二级质谱鉴定是蛋白质鉴定的一大趋势，即使目前进行质谱鉴定，有必要选择一些 PMF 结果进行二级质谱验证。

Q2：如果研究的物种不是模式生物，应该怎么做？
A：通过参考亲缘关系最近的模式生物，可以成功鉴定出蛋白质。  如果质谱图很好但没有鉴定结果，则表明这可能是一种全新的蛋白质。  从头等技术可用于深度分析和识别。

Q3：如何评价质谱的有效性？
A：PMF评分超过60分（P<0.05）一般认为是成功的。  对于串联质谱，得分超过 60 分或虽然不超过 60 分，但至少有一个得分超过 30 分的肽将被成功鉴定。

Q4：一些特殊的质谱方法有什么用途？
A：质谱的其他用途包括磷酸化位点分析、蛋白质测序、混合蛋白质鉴定（鸟枪技术）、准确测定分子量、二硫键位置分析等。

Q5：哪种染色方法比较好？
A：考马斯亮蓝染色是首选。  银染也可以，但鉴定成功率略低，使用串联质谱法鉴定银染蛋白可以大大提高鉴定成功率。

Q6：凝胶可以长期保存吗？  如何保养？  会不会影响识别效果？
答：如果凝胶保存超过一个月，应该用保鲜膜包裹并保存在冰箱中。  如果时间小于1个月，可以在室温下保存，不影响质谱分析。

Q7：质谱的凝胶点怎么取？  有什么预防措施吗？
A：取穴时，将0.2ml吸头的尖端剪断，用移液器吸头取出凝胶，转移到0.5ml离心管中。  用水冲洗珠子两到三次，然后吸干管子。  保持所有防潮密封件就位并标记它们。  离心管最好选用进口离心管，避免塑料污染。   最好使用去离子水或双蒸水。  带上口罩和手套以防止角蛋白污染。

Q8：凝胶可以长期保存吗？  如何储存和运输？
A：蛋白胶可以长期保存，不影响质谱鉴定。  一般来说，如果是一两周内，最好用保鲜膜包好，存放在4度的冰箱里。   若保存时间超过1个月，可将蛋白斑点取出，置于-20℃或-80℃冰箱中，不影响后续质谱鉴定。  运输胶点时，可以常温运输，三到五天不会有太大影响。

Q9：一级质谱和二级质谱如何选择？
答：主要的质谱鉴定方法通常称为肽质量指纹 (PMF)。  二级质谱鉴定方法通常称为串联质谱。   早期蛋白质鉴定，考虑到成本，测序生物的蛋白质鉴定一般可以用一级质谱仪来完成，而非测序的生物往往选择二级质谱仪。   但现在，二级质谱仪的价格也大大降低，与一级质谱仪的价格相差不大，无论是可靠性还是识别成功率都有很大的提高。

Q10：质谱的一般流程是什么，企业可以提供哪些数据？
A：质谱鉴定主要包括三个步骤：蛋白水解、质谱数据采集、库检索。   对于每个蛋白点的识别，一般提供三类数据，包括：质谱图（PDF格式，包括1张一级质谱和5-10张二级质谱）、质谱峰列表（文本格式，主要部分MS片段信息）和搜索结果（自建库通用PDF格式或excel格式本地化搜索；Mascot在线搜索通用网页格式）。

Q11：影响质谱结果的一般因素有哪些？
A：质谱鉴定不成功主要分为两类。  一个原因是质谱无效，另一个是没有参考数据的蛋白质数据库。  导致质谱结果不成功的原因可细分为：（1）蛋白点过浅，蛋白含量过低；   (2)蛋白点太小，不利于操作；  （3）虽然用二维电泳分离，但重点是几种蛋白质的混合物；  (4)蛋白水解和质谱误差。

为避免这些因素，需要取较暗的蛋白点，蛋白点面积需要适当大一些（对于一些小但非常清晰的蛋白点，应选择孔径较大的样品尖端。边缘上的空白是否被正确拾取并不重要）。  避免点混合蛋白斑点，在酶解和质谱分析方面拥有丰富的经验。   通过更换较大的数据库，取EST数据库，在单一物种蛋白质数据库的基础上建立本地质谱数据库，可以解决因没有参考数据库而导致鉴定结果不佳的问题。

Q12：串联质谱和质谱测序有什么区别？
A：质谱鉴定通常使用软件自动匹配现有数据库以获得结果。  而质谱测序需要根据质谱图中相邻或相似峰的分子量差异直接计算肽序列。

Q13：未知蛋白质是质谱测序还是蛋白质测序仪测序？
A：比较简单的方法是质谱，成本也不贵。  如果质谱不能确定，也可以结合N端测序。  这两个数据组合分析基本可以确定目标蛋白。